《Life》：The In Vivo Evaluation of PbS Nanoparticle-Based Solution on Avian Embryo as an Animal Model
编辑推荐：
硫化铅纳米颗粒（PbS NPs）是生物医学成像领域具有应用前景的材料。然而，其在胚胎发育过程中的安全性仍未得到充分探索。本研究首次采用鸡胚毒性筛选试验（Chick Embryotoxicity Screening Test, CHEST）和绒毛尿囊膜（chor
硫化铅纳米颗粒（PbS NPs）是生物医学成像领域具有应用前景的材料。然而，其在胚胎发育过程中的安全性仍未得到充分探索。本研究首次采用鸡胚毒性筛选试验（Chick Embryotoxicity Screening Test, CHEST）和绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）试验，评估了PbS NPs的发育毒性、肝脏效应、血管生成活性及刺激潜力。研究人员将不同浓度（6%、10%、12%、20%、25%、50%和100%）的PbS NPs暴露于受精鸡蛋，通过死亡率、体重及选定器官重量、畸形发生率、肝脏组织学改变及抗氧化相关基因的逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）评估发育毒性，并采用CAM试验定量评估血管参数，随后进行刺激潜力分析。胚胎暴露于PbS NPs后出现浓度依赖性的发育效应，最高浓度下胚胎死亡率达56%，存活胚胎中观察到发育畸形。肝脏未见组织学改变；然而，较高浓度改变了α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）表达和细胞增殖活性，并调节了抗氧化基因的表达。在CAM试验中，最高浓度的PbS NPs显著降低了血管总面积、分支数量及血管总长度，同时仅诱导轻度刺激反应，表现为血管扩张。上述研究结果表明，在实验条件下，胚胎直接暴露于PbS NPs后出现浓度依赖性的发育和血管反应，且仅在最高浓度下，短期暴露才引起显著的形态学、血管生成及分子水平改变。本研究为PbS NPs在鸡胚发育过程中的安全性提供了综合评价，支持其作为生物医学成像材料的进一步研究潜力，同时表明CHEST与CAM试验联合可作为临床前发育纳米毒性评估的互补模型。
**基于鸡胚模型的PbS纳米颗粒发育毒性评价**
**一、研究背景与科学问题**
量子点（quantum dots, QDs）因其高亮度、光稳定性和尺寸依赖的发光特性，在生物医学成像领域具有广阔的应用前景。其中，核糖核酸酶A包裹的硫化铅量子点（PbS QDs）能够发射近红外（near-infrared, NIR）荧光，可减少光吸收和散射并降低自发荧光背景，适合深组织可视化。然而，这类纳米材料在胚胎发育阶段的安全性数据仍然匮乏，是制约其临床转化的重要瓶颈。
传统啮齿类动物模型受到伦理、实践和技术层面的限制。禽类胚胎具有发育在母体之外、免疫系统在发育后期（第12胚胎日）之前尚不成熟、操作简便且成本低廉等优势，已成为胚胎毒性和血管生成研究的重要替代模型。鸡胚与哺乳动物胚胎在形态、生理和生化方面具有诸多相似性，且孵化周期短、实验操作简便，可用于致畸效应评估和治疗药物的发育毒性筛选。
在胚胎毒性检测方面，鸡胚毒性筛选试验（Chick Embryotoxicity Screening Test, CHEST）是一种经过验证的替代模型，聚焦于鸡胚器官形成期，在胚胎第3天和第8天通过胚下腔或羊膜腔内途径给予受试物，可检测发育迟缓、畸形和死亡等胚胎毒性表现，且具有廉价、操作简便和时间优势。此外，绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）是禽胚高度血管化的胚外膜，参与钙转运、气体交换和酸碱平衡等生理过程，其血管反应与哺乳动物模型可比，可用于快速评估血管生成活性和血管活性。CAM模型符合3Rs原则，居于体外模型和哺乳动物体内模型之间的中间测试阶段。
本研究旨在利用CHEST和CAM试验，首次系统评价不同浓度PbS纳米颗粒（PbS NPs）直接胚胎暴露后的发育毒性、肝脏效应、血管生成活性及刺激潜力。
**二、研究设计与技术方法**
研究人员从斯洛伐克共和国尼特拉Párovské Háje养鸡场获取Lohmann Brown品种受精鸡蛋。PbS NPs按照既往报道方案制备，由蛋白质纳米颗粒（99%）包裹PbS量子点（1%；约25 nM）。CHEST试验中，59枚受精鸡蛋于胚胎第4天（embryonic day 4, ED4）经气室通过内卵壳膜给予100 μL不同浓度PbS NPs溶液（6%、12%、25%、50%、100%），对照组给予等量生理盐水，于ED9进行采样评估。CAM试验中，53枚鸡蛋于ED3胚外培养，ED7时将硅胶环置于CAM表面并给予30 μL不同浓度PbS NPs溶液（10%、20%、50%、100%），ED10采集图像并利用IKOSA PRISMA CAM软件定量分析血管参数。刺激潜力评价（HET-CAM）采用20枚ED9鸡胚，依据Luepke评分系统评估充血、出血和凝血反应的时程变化。主要技术方法包括：透射电子显微镜和动态光散射表征纳米颗粒、苏木精-伊红染色组织学分析、免疫荧光染色（α-SMA和磷酸化组蛋白H3）、两步RT-qPCR检测抗氧化基因表达、以及CAM血管网络定量分析。
**三、主要研究结果**
**1. PbS NPs的表征。**透射电子显微镜显示PbS NPs呈球形、分散良好；动态光散射测定平均水合直径约16.5 nm；光致发光光谱显示以约1120 nm为中心的对称发射峰，确认近红外荧光特性；平均Zeta电位为-18.2 mV，表明具有适度的静电稳定性。
**2. 鸡胚毒性筛选试验（CHEST II）。**ED4给予不同浓度PbS NPs后，胚胎发育呈非线性的浓度依赖性改变。6%、12%和25%浓度组胚胎体重均较对照组显著降低，6%和12%组肝重亦显著下降，而心脏仅在6%和12%组显著降低。浓度最高的50%和100%组未显示显著差异。胚胎死亡率随浓度升高而增加，100%组死亡率最高（56%）。大体形态学检查发现，25%组一例胚胎出现轻度颅周及眼周水肿、喙缩短和肢体发育减少；50%组一例胚胎出现更严重的颅周及眼周水肿、喙缩短、肝脏移位和肢体发育受损。
**3. 组织学分析。**对照组肝脏呈现典型形态学特征，肝细胞呈圆柱状或锥形，核圆形且富含常染色质，排列成腺泡或双行索状，肝窦由内皮细胞衬覆。所有PbS NPs处理组（6%至100%）肝实质未见显著形态学改变，肝细胞大小和形态保持正常，腺泡和肝索的微细结构排列未见异常，仅在肝细胞胞质中观察到少量微小脂滴。
**4. 免疫组织化学分析。**对照组α-SMA免疫反应性主要定位于血管周围和沿肝窦壁分布。6%和12%组α-SMA分布与对照组基本相似，而25%、50%和100%组α-SMA阳性结构在切片中呈现不规则排列，空间分布发生改变。磷酸化组蛋白H3（phospho-histone H3, PHH3）阳性细胞核在对照组中分布广泛，反映胚胎肝脏发育过程中的生理性增殖活性；25%和50%组PHH3阳性细胞核密度降低，100%组分布更为稀疏且不规则。上述免疫组织化学观察为定性结果。
**5. 抗氧化基因表达分析。**RT-qPCR结果显示，与未处理对照组相比，超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2, SOD2）在25%（0.65倍）、50%（0.56倍）和100%（0.54倍）浓度组中均显著下调。过氧化氢酶（catalase, CAT）表达呈现类似趋势，在25%（0.44倍）、50%（0.65倍）和100%（0.37倍）浓度组中均显著下调。谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione peroxidase 1, GPX1）仅在50%组中显著上调（2.15倍）。
**6. 胚外CAM血管生成评价。**定量分析显示，所有PbS NPs处理组的总血管面积均较对照组显著降低，其中100%组抑制最显著，血管面积较对照组减少约45–50%；总血管长度在10%、50%和100%组显著下降；平均血管厚度在各组间无显著差异；分支点数在10%、50%和100%组显著减少，表明血管网络复杂性降低。
**7. 刺激潜力评价。**根据Luepke评分系统，对照组在240 s观察期内未见明显血管变化。所有PbS NPs浓度均仅诱导轻度刺激反应，表现为应用后30–120 s内出现充血（血管扩张），整个观察期内未检测到出血和凝血现象。
**四、讨论与结论**
研究人员在讨论部分指出，PbS NPs经胚外膜途径给予受精鸡蛋与原始CHEST方法存在给药途径差异，系基于纳米颗粒溶解性和容量依赖性毒性的实际考量。CHEST试验中使用的浓度属于超剂量暴露，基于胚胎与成年动物的体重差异，其剂量关系与成年动物全身暴露场景存在根本区别。既往生物安全性评价是在与生物医学成像应用条件相关的成年动物模型中进行的，暴露途径和观察周期均与本研究不同。研究观察到的非单调剂量-反应关系可能反映浓度依赖性纳米颗粒聚集、生物利用度、细胞摄取或适应性生物学响应的差异，存活胚胎在最高浓度组中畸形表现较少可能系选择性存活效应或高浓度下纳米颗粒分散性改变所致。
肝脏组织学结构在各浓度下均保持完整，但免疫荧光和分子分析揭示细胞应激和血管重塑相关改变。高剂量下α-SMA阳性结构分布的不规则改变提示血管重塑和间充质细胞活化，而PHH3阳性细胞减少可能反映发育延迟、暴露诱导的细胞应激或资源向维持修复通路的重新分配。SOD2和CAT的下调提示抗氧化防御系统调节受损，50%组GPX1的代偿性上调在最高浓度下消失，表明高浓度下抗氧化防御不足以完全代偿分子改变。CAM血管生成受损与仅轻度急性刺激反应之间的差异，提示应区分短期刺激效应与长期发育性血管毒性。
研究局限性包括：CHEST模型给予的是整个受精卵而非直接胚胎暴露，无法精确确定实际内剂量和生物分布；PbS NPs在生物条件下可能发生理化转变并释放铅离子，完整纳米颗粒和释放铅物种的相对贡献尚不明确；免疫组化结果缺乏定量分析；分子评估限于特定抗氧化基因，未来应结合活性氧水平、脂质过氧化和氧化性DNA损伤等直接氧化应激指标。
**研究结论：**本研究首次采用CHEST和CAM试验评价了PbS NPs的发育毒性和生物相容性，符合3Rs替代毒理学检测原则。总体结果表明，PbS NPs在较高浓度下仍表现出良好的生物相容性和较低的胚胎毒性潜力，仅在超剂量暴露水平下才影响胚胎存活、降低微血管复杂性、抑制有丝分裂活性、改变α-SMA表达并调节抗氧化基因表达。上述高剂量反应凸显了区分生物医学成像相关剂量与极端实验暴露剂量的重要性。本研究为PbS NPs在鸡胚发育过程中的安全性提供了综合评价，支持其在生物医学成像领域进一步研究的潜力。
