聚乳酸-羟基乙酸共聚物包封硒微球序贯预处理重塑肠道菌群并增强PLGA包封口服亚单位疫苗抗大口黑鲈蛙病毒保护效力

《Vaccines》：Sequential PLGA-Encapsulated Selenium Microsphere Pretreatment Enhances Protective Efficacy of PLGA-Encapsulated Oral Subunit Vaccine Against Largemouth Bass Ranavirus in Micropterus salmoides

　　

背景：大口黑鲈蛙病毒（LMBV）在养殖大口黑鲈（Micropterus salmoides）中引起高死亡率。口服亚单位疫苗适合鱼类大规模免疫，但常产生不理想免疫效果。肠道菌群强烈调节黏膜免疫能力。本研究评估PLGA/硒纳米颗粒（P/Se）预处理是否增强基于PLGA的口服亚单位疫苗（P/V）对LMBV的保护。方法：采用2 × 2析因设计。鱼接受28天口服P/Se预处理，随后三次口服P/V。开展材料表征、16S rRNA高通量测序结合微生物组装分析（多样性、归一化随机性比率（NST）、Sloan中性模型）、免疫相关基因定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、血清特异性抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）、LMBV浸泡攻毒和组织病理学检查。结果：P/Se和P/V微球成功制备，具有可接受粒径和载药效率。P/Se预处理显著提高肠道微生物α多样性并富集放线菌门（Actinobacteriota），同时增加随机过程对肠道群落组装的相对贡献。预处理-疫苗联合组显著上调肠道黏膜免疫基因（IL-1β、IL-8、IFN-γ、TNF-α、IgT）和系统性IgM。一致地，该联合组观察到更高血清特异性IgM抗体水平、更高存活率以及减轻病毒诱导的躯干肾和肝病理损伤。单独接种仅提供有限保护，单独预处理未产生明显抗病毒保护。结论：P/Se序贯干预重塑肠道菌群并增强口服亚单位疫苗保护效力。该序贯投喂策略为优化养殖大口黑鲈口服疫苗性能提供了可行途径。

研究背景与问题：大口黑鲈（Micropterus salmoides）是中国重要淡水养殖鱼类，养殖规模持续扩大。大口黑鲈蛙病毒（LMBV；蛙病毒属病原）可感染多种鲈科鱼类，养殖和野生群体中流行，暴发造成大量死亡并制约产业健康发展。接种疫苗是水生动物疾病防控的主流环保策略；与注射疫苗相比，口服疫苗具有给药方便、减少操作应激、适合大规模群体投递等优势，但当前水产口服疫苗普遍免疫应答弱或不稳定，限制实际应用。鱼肠道是最大黏膜免疫器官，肠道微生物稳态与宿主免疫应答紧密相关；肠道微生物多样性降低可损害肠道免疫功能、改变黏膜免疫细胞因子和免疫球蛋白表达，削弱宿主识别和应答抗原的能力。现代水产饲料原料多样性窄、长期投喂相似饲料可驱动肠道菌群趋同并降低功能多样性。因此，用环保生物制品预调理肠道菌群和免疫状态，是提高口服疫苗效力的潜在策略。硒纳米颗粒（SeNPs；低毒高活性功能材料）具有抗氧化、抗炎和免疫调节作用，水产饲料添加可增强免疫和抗氧化基因转录并重塑肠道菌群，但游离SeNPs易被胃酸和消化酶降解。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA；生物相容可降解聚合物载体）可有效包封生物活性物质并保护其免受胃肠道降解；PLGA微球包封SeNPs可提高消化道内Se⁰稳定性，PLGA微球也是口服疫苗载体，可保护蛋白抗原免受酶降解并提高口服抗原递送效率。研究假设为：28天口服PLGA包封SeNPs预处理可重塑肠道菌群和调节肠道免疫微环境，并增强后续PLGA包封口服亚单位疫苗（P/V）对LMBV的保护性免疫应答。

研究设计与总体结论：研究人员采用2 × 2析因设计，设Control、Control-P/V、P/Se-Control和P/Se-P/V四组。P/Se预处理自第0天起连续28天投喂含P/Se饲料（硒含量1 mg/kg），对照投喂等量基础饲料；随后于第29、31、35天进行三次口服免疫，P/V中tMCP-FlaC含量为100 mg/kg；第56天以LMBV（1.0×10⁵ copies/mL）浸泡2 h攻毒，观察21天至第77天。研究整合材料表征、16S rRNA高通量测序与微生物组装分析、qRT-PCR、血清特异性抗体ELISA、LMBV浸泡攻毒和组织病理学检查。总体结论为：P/Se序贯预处理可重塑肠道菌群并增强P/V口服亚单位疫苗的保护效力；单独P/Se预处理无直接抗病毒保护，单独接种仅有限保护，联合组保护最强。

关键技术方法概括：实验对象为健康大口黑鲈（15.33 ± 0.45 g），于室内循环水系统暂养；LMBV毒株为实验室?80 °C保存。采用2 × 2析因和口投P/Se、P/V；以扫描电子显微镜（SEM）观察形态和粒径，电感耦合等离子体（ICP）测硒载量，二喹啉甲酸（BCA）法测蛋白载量；对肠道内容物进行16S rRNA V3–V4区Illumina MiSeq测序，分析α/β多样性、线性判别分析效应量（LEfSe）、归一化随机性比率（NST）和Sloan中性模型；以qRT-PCR检测免疫基因，ELISA检测血清特异性抗体，并进行LMBV浸泡攻毒和H&E组织病理检查。

研究结果：
3.1 PLGA包封SeNPs与口服疫苗微球的制备与表征：通过SEM、SDS–PAGE、Western blotting、ICP和BCA等表征显示，未包封SeNPs近球形、粒径约150 nm；纯化tMCP-FlaC融合蛋白在约73 kDa处呈特异条带，与理论分子量一致；P/Se和P/V微球总体呈规则球形、表面较光滑，平均粒径分别为20.78 ± 7.13 μm和19.62 ± 5.96 μm，粒径分布较均匀；P/Se硒载效率为1.03 ± 0.03%，P/V蛋白载效率为2.06 ± 0.02%。结论是两种微球成功制备并具有可接受粒径和载药效率。

3.2 P/Se预处理对大口黑鲈肠道菌群的影响：通过16S rRNA测序分析发现，在门水平P/Se预处理明显提高Actinobacteriota相对丰度并改变肠道细菌群落总体组成；科水平分布模式亦明显不同。α多样性分析显示P/Se组Chao1、Faith’s phylogenetic diversity和Simpson指数显著高于对照，所有样本Good’s coverage超过0.997；β多样性显示两组在排序空间明显分离，群落结构差异显著（PERMANOVA：pseudo-F = 18.6，R² = 0.37，p = 0.0038）；LEfSe显示Actinobacteriota相关类群主要在P/Se组富集，代表差异属包括Aurantimicrobium、Rhodoglobus和Aestuariivirga。结论是P/Se预处理重塑肠道菌群结构并显著提高细菌丰富度和多样性。

3.3 P/Se预处理对肠道菌群生态组装的影响：通过生态位分类、NST和Sloan中性模型分析显示，P/Se组与对照组微生物生态位宽度差异极显著；两组中中性过程主导类群占比最大，广适型（generalists）次之，专性型（specialists）很少；P/Se组NST值显著高于对照，提示随机过程对肠道微生物群落组装的相对贡献增加；Sloan中性模型拟合中，全部样本R²为0.236，P/Se组和对照组R²分别为0.691和0.641。结论是P/Se处理改变不同生态位类别类群比例并增强中性生态过程对群落组装的贡献。

3.4 P/Se预处理联合P/V对免疫相关基因表达的影响：通过qRT-PCR检测肠道和头肾免疫相关基因发现，P/Se-P/V组肠道促炎基因IL-1β、IL-8、IFN-γ、TNF-α和免疫球蛋白基因IgT转录水平显著高于Control、P/Se-Control和Control-P/V组，提示联合处理诱导适度但显著的肠道炎症和黏膜免疫应答激活；P/Se-P/V组头肾IgM表达亦显著高于所有其他组；未接受疫苗刺激的组未见所检免疫相关基因明显上调。结论是P/Se预处理增强口服P/V诱导的免疫激活。

3.5 抗LMBV感染保护效力评价：通过ELISA和攻毒试验显示，Control与P/Se-Control组血清特异性抗体水平无显著差异；Control-P/V组显著高于Control组及PS组（原文缩写）；P/Se-P/V组血清抗体吸光度最高，显著高于其他三组。21天累计存活率分别为Control 33.3%、Control-P/V 46.7%、P/Se-Control 36.7%、P/Se-P/V 80.0%；相对存活率（RPS）分别为Control-P/V 20.1%、P/Se-Control 5.1%、P/Se-P/V 70.0%。P/Se-P/V组存活率和RPS最高，显著高于其他组；P/Se-Control组RPS可忽略，说明单独P/Se预处理不提供直接抗病毒保护。组织病理显示P/Se-P/V组躯干肾肾小管完整、肝细胞排列规则且无明显病变；Control、Control-P/V和P/Se-Control组可见肾小管上皮细胞脱落和肝明显空泡变性。结论是联合处理提高特异性体液免疫、改善攻毒后存活并减轻LMBV所致组织损伤。

讨论总结与结论翻译：讨论指出，LMBV感染造成大规模死亡并威胁大口黑鲈养殖可持续发展；口服疫苗具有给药方便、低应激和适合大规模免疫等优势，但口服递送系统普遍免疫原性不足、保护效力不稳定。本研究采用时间序贯干预：先以P/Se微球投喂28天调节宿主免疫状态和肠道微环境，再给予PLGA包封重组tMCP-FlaC蛋白亚单位口服疫苗，系统评价该预处理对口服疫苗抗LMBV保护性免疫的增强作用。原文承认P/Se和P/V表征仅限表面形态、粒径和载效率，未评估体外抗原释放动力学、模拟胃肠pH和酶条件稳定性及长期储存稳定性；约20 μm粒径处于鱼类口服PLGA微球疫苗有效范围，体内保护数据支持制剂在现行投喂方案下实现功能性递送。原文说明纳米硒1 mg/kg设定参考以往鱼类研究；LMBV主要衣壳蛋白（MCP）具较好免疫原性，FlaC作为分子佐剂经TLR5通路触发免疫应答，tMCP-FlaC融合抗原基于MCP表位定位构建。讨论认为长期投喂配合饲料易致肠道菌群均质化和α多样性下降，而α多样性降低常伴随黏膜免疫应答受损和黏膜抗原识别能力下降，可能是口服疫苗效果不稳定的原因之一；P/Se预处理提高Chao1、Simpson和Faith-pd等α多样性指数、富集Actinobacteria相关类群、改变生态位宽度并增强随机过程贡献，提示可缓解单一饲料所致菌群多样性下降并重塑菌群。原文同时指出富集菌（如Aurantimicrobium、Rhodoglobus、Aestuariivirga）在鱼类肠道免疫中的具体作用尚不明确，随机性升高反映向中性群落组装转变，不一定表示更健康或更有益，需宏基因组或代谢组研究。免疫基因上调中，IgT为鱼类关键肠道黏膜抗体，IgM反映系统性体液免疫水平，促炎细胞因子上调提示局部肠道免疫有效激活。原文推测肠道微生物α多样性升高可能是P/Se增强口服疫苗免疫反应的潜在途径之一；但因未进行菌群清除、粪菌移植或无菌实验，不能区分菌群改变与硒/PLGA直接免疫调节的因果贡献，菌群多样性和组成变化应解释为相关性。保护效力评估中，特异性抗体和攻毒后存活联合分析显示联合处理增强特异性体液免疫并提高LMBV感染后存活率，组织完整性更好、病变更少；未来需在攻毒后多个时间点定量靶组织病毒载量以直接确认疫苗是否降低病毒复制。应用方面，28天P/Se预处理加三次口服接种与标准投喂方案兼容，PLGA微球可在制粒时混入饲料或以油性黏合剂外包；但仍需优化PLGA微球生产成本和规模化、验证含抗原饲料在养殖场储存条件下的稳定性、确定相对于LMBV典型暴发季节的最佳时机，并开展养殖现场试验。研究结论翻译：P/Se序贯口服预处理有效重塑大口黑鲈肠道菌群，提高肠道微生物α多样性及群落组装中的随机贡献。与P/V口服疫苗联合时，该预处理显著促进黏膜和系统性免疫激活，提高特异性血清抗体水平，改善攻毒后存活率，并减少LMBV引起的躯干肾和肝组织学病变。单独P/Se预处理未产生可检测的抗病毒保护，单独接种仅产生有限保护结果。然而，现有数据不能区分增强的疫苗保护是由观察到的菌群重塑介导，还是由硒本身的直接免疫调节介导。该序贯投喂策略是增强大口黑鲈养殖中抗LMBV口服亚单位疫苗性能的有前景实用方法。