《iScience》：Identification of mitophagy-related genes with diagnostic value in focal segmental glomerulosclerosis using bioinformatics analysis
编辑推荐：
局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis, FSGS）是导致终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的主要病因，其病理特征涉及足细胞损伤与免疫失调。研究人员整合基因表达综合数据库
局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis, FSGS）是导致终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的主要病因，其病理特征涉及足细胞损伤与免疫失调。研究人员整合基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）转录组数据集，通过差异表达分析和加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）鉴定出839个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）和33个差异线粒体自噬相关基因（differentially expressed mitophagy-related genes, DMRGs）。机器学习筛选出六个候选诊断生物标志物，即SLIRP、BLVRB、ATP6V1F、COX5B、TMEM14A和TRMT112，其在多个队列中均表现出中等至良好的区分能力。xCell分析揭示FSGS中存在广泛的肾脏免疫重塑，表现为促炎细胞扩增、初始T细胞和调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）减少，且核心基因与免疫谱密切相关。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）分析提示FSGS足细胞中核心基因存在下调趋势，同时线粒体能量代谢和线粒体自噬相关通路的转录组特征受到抑制。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和蛋白质印迹（western blot）在FSGS小鼠模型的全肾组织水平验证了这些基因的下调。上述六个基因可能作为诊断候选基因，并为探索FSGS中线粒体自噬机制提供研究线索。
局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis, FSGS）是一种以局灶节段性肾小球硬化为特征的常见临床病理综合征，主要表现为蛋白尿或肾病综合征。FSGS是全球范围内终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的主要病因之一。目前包括糖皮质激素、免疫抑制治疗和肾移植在内的治疗方案，常因促炎或促纤维化环境中的免疫改变而效果不佳，且部分患者移植后出现FSGS复发。FSGS的初始损伤发生在足细胞——一种对肾小球滤过屏障至关重要的高度分化上皮细胞。足细胞再生能力有限，易受遗传缺陷、免疫因素、感染、代谢应激和血流动力学损伤的影响，导致不可逆损伤，表现为足细胞丢失、肾小球基底膜暴露和毛细血管塌陷。数据表明，足细胞耗竭超过20%可介导FSGS发生，超过40%则触发进行性肾小球硬化。
足细胞依赖糖酵解和线粒体代谢提供大量能量以维持其复杂结构和多方面功能。除供能外，线粒体还调节活性氧（reactive oxygen species, ROS）、细胞内钙稳态、细胞增殖以及多种细胞死亡形式。在应激条件下，受损或功能障碍的线粒体产生过多ROS和促凋亡因子，需通过线粒体自噬（mitophagy）进行选择性降解以维持细胞稳态。小鼠肾上皮细胞中自噬基因（如ATG5或ATG7）破坏的研究表明，自噬受损可在两个月内导致轻度足细胞和肾小管功能障碍，四个月时出现FSGS样病理改变，六个月时进展为肾功能衰竭。人类特发性FSGS肾活检标本中可见形态学异常的功能障碍线粒体，凸显了线粒体自噬在线粒体质量控制中的重要作用。因此，调节线粒体质量控制和线粒体自噬对于改善FSGS并延缓其向ESRD进展具有重要潜力。
研究人员利用两个GEO数据集鉴定FSGS与对照样本之间的DEGs，采用WGCNA筛选FSGS相关模块基因，并与线粒体自噬相关基因取交集获得DMRGs。通过基因本体论（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）富集分析探索其生物学功能和通路。机器学习（随机森林和支持向量机）进一步筛选出六个候选基因，其诊断性能通过内部和外部数据集以及列线图模型得到验证。xCell免疫浸润分析用于表征肾脏免疫细胞重塑及核心基因与免疫谱的相关性。scRNA-seq数据进一步推断足细胞相关的表达模式以及线粒体代谢和线粒体自噬通路的改变。最后，研究人员利用体内FSGS小鼠模型肾组织，通过qRT-PCR和western blot验证候选基因的表达趋势，旨在为FSGS的预防和诊断提供潜在生物标志物。
在结果部分，研究人员首先通过差异表达分析鉴定了839个DEGs（276个上调，563个下调）。WGCNA鉴定出212个FSGS相关模块基因，与DEGs和GeneCards数据库中5,150个线粒体自噬相关基因取交集后获得33个DMRGs。GO和KEGG分析表明DMRGs参与翻译、线粒体功能、蛋白质结合、RNA结合、核糖体结构以及氧化磷酸化等通路。利用RF-RFE和SVM-RFE两种机器学习算法，研究人员鉴定出六个核心候选基因：SLIRP、BLVRB、ATP6V1F、COX5B、TMEM14A和TRMT112。为克服初始样本量有限的局限，研究人员整合了六个公共FSGS肾脏转录组数据集（共239个样本：50个健康对照，189个FSGS病例）进行大样本验证。经ComBat算法批次校正后，100次5折交叉验证显示模型平均AUC为0.932（95% CI: 0.916–0.943），1000次标签置换检验证实原始模型AUC为0.942（p < 0.001），排除了随机效应或过拟合的可能。基于六个候选基因构建的列线图模型可用于预测FSGS风险，其中SLIRP和COX5B高表达以及BLVRB、ATP6V1F、TRMT112和TMEM14A低表达提示较高风险。
xCell免疫浸润分析显示FSGS病变中存在显著免疫失调：树突状细胞（dendritic cells, DC）、活化树突状细胞（activated dendritic cells, aDC）、CD4效应记忆T细胞（CD4 Tem cells）、CD8效应记忆T细胞（CD8 Tem cells）、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、M2巨噬细胞、自然杀伤T细胞（natural killer T cells, NKT）和γδT细胞（gamma delta T cells, Tgd）浸润显著增加，而初始CD4 T细胞、初始CD8 T细胞、中性粒细胞和Tregs显著减少。相关性分析发现六个核心基因与多种免疫细胞显著相关，如ATP6V1F、COX5B、BLVRB、TRMT112和SLIRP与中性粒细胞正相关，TMEM14A与巨噬细胞和CD8 Tem细胞负相关等。
ROC曲线验证结果显示，在内部数据集中，SLIRP、BLVRB、ATP6V1F、COX5B、TMEM14A和TRMT112的AUC值分别为0.852、0.936、0.927、0.902、0.913和0.907；在外部数据集GSE104948中AUC值分别为0.774、0.597、0.618、0.757、0.642和0.878；在GSE104954中AUC值分别为0.821、0.739、0.616、0.706、0.709和0.625。总体而言，六个基因在外部队列中保持了可接受的预测能力。
多队列相关性分析显示，大多数核心基因与经典线粒体自噬分子（PINK1、MAP1LC3B、SQSTM1、TOMM20、COX4I1、BNIP3、BNIP3L）呈一致的正相关。基于两个独立线粒体自噬基因集的GSVA分析进一步验证了线粒体自噬通路活性与六基因标签评分在所有队列中均呈正相关。预排序GSEA显示共表达基因在自噬-溶酶体通路、线粒体形态组织、线粒体膜电位调节和ROS代谢过程中显著富集。
scRNA-seq分析（GSE146912数据集，包含3个正常对照小鼠肾脏和2个阿霉素诱导FSGS小鼠肾脏）共获得23,053个高质量肾脏细胞，注释为7个主要细胞簇：足细胞（4,317个）、内皮细胞（12,226个）、系膜细胞（3,867个）、免疫细胞（1,024个）、壁层上皮细胞（532个）、平滑肌细胞（519个）和未知细胞（568个）。六个核心基因均在足细胞中稳定表达。在FSGS足细胞中，SLIRP、BLVRB、COX5B和TRMT112的表达显著下调（p < 0.05），ATP6V1F和TMEM14A也呈现一致的下调趋势。GSEA分析显示FSGS足细胞中“质子动力驱动线粒体ATP合成”通路显著下调（NES = ?1.52, p < 0.05），“2型线粒体自噬”（NES = ?1.61, p < 0.05）和“线粒体自噬正调控”（NES = ?1.53, p < 0.05）通路均受到抑制，提示能量生成障碍与受损细胞器清除失败形成恶性循环，驱动FSGS进展。
在动物模型验证中，研究人员通过单次尾静脉注射阿霉素建立FSGS小鼠模型。与对照组相比，阿霉素组血肌酐水平显著升高，PAS染色显示肾小球节段性硬化、基底膜增厚、系膜基质扩张和肾小管萎缩。qRT-PCR显示SLIRP、BLVRB、COX5B、TMEM14A和TRMT112的mRNA表达显著下调，ATP6V1F呈下降趋势但无统计学意义。Western blot结果与qRT-PCR趋势一致，SLIRP、BLVRB、COX5B、TMEM14A和TRMT112在蛋白水平显著下调，ATP6V1F在蛋白水平也呈现统计学显著下调。
在讨论部分，研究人员指出本研究中六个候选基因与既往报道的FSGS转录组生物标志物标签无重叠，补充了线粒体自噬相关基因面板作为FSGS研究的额外互补生物标志物资源。SLIRP作为线粒体RNA结合蛋白，通过LRPPRC-SLIRP复合物稳定mRNA并调节翻译；BLVRB作为胞质酶，还原胆绿素为胆红素，参与血红素分解代谢和抗氧化防御；ATP6V1F是液泡H+-ATP酶亚基，对溶酶体酸化和自噬至关重要；COX5B是细胞色素c氧化酶亚基，支持线粒体呼吸；TMEM14A是线粒体膜蛋白，调节血红素生物合成；TRMT112是tRNA/rRNA甲基转移酶的辅因子，确保RNA稳定性和蛋白质合成。这些基因的协同下调可能损害线粒体稳态并促进足细胞损伤。免疫浸润分析证实FSGS存在以促炎效应免疫细胞富集和初始/调节性免疫亚群减少为特征的显著免疫浸润失衡。单细胞转录组分析进一步揭示损伤的FSGS足细胞激活细胞应激反应和代谢适应，同时线粒体氧化磷酸化和线粒体自噬相关通路显著抑制。
研究结论：线粒体自噬参与FSGS发病机制，本研究整合转录组数据、WGCNA和机器学习筛选线粒体自噬相关基因，鉴定出六个候选核心基因（SLIRP、BLVRB、ATP6V1F、COX5B、TMEM14A和TRMT112）。多队列转录组分析证实该标签与线粒体自噬和线粒体功能相关通路的转录组改变密切相关。ROC和列线图分析显示该基因标签在独立队列中具有总体可接受的区分能力，且与FSGS肾脏免疫失调密切相关。单细胞转录组学提示这些基因在FSGS足细胞中呈下调趋势，同时伴随线粒体能量代谢和线粒体自噬相关通路的抑制。这些表达改变在阿霉素诱导的小鼠模型全肾组织水平得到进一步验证。综上，研究结果揭示了核心基因下调、足细胞线粒体通路转录组改变与肾脏免疫失衡之间可能存在的相关性趋势，可为FSGS的线粒体机制研究提供候选生物标志物和研究线索。
