三维肠道支架支持粪类圆线虫感染性幼虫体外形态发育的研究

《Pathogens》：A 3D Intestinal Scaffold Supporting In Vitro Morphological Changes in Strongyloides stercoralis Infective Larvae

　　

粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）是一种土源性蠕虫，其生活史复杂，具有建立慢性感染的能力。寄生虫与宿主肠道环境之间复杂的相互作用是疾病发病机制的核心。本研究探索了传统的二维（2D）培养系统以及一种新型的体外平台——定制三维（3D）支架，该支架旨在模拟肠道微结构，用于寄生虫的体外维持与生长。研究人员使用人肠道上皮Caco-2细胞和粪类圆线虫感染性幼虫（iL3）临床分离株，评估了幼虫在基础条件下及甾体类刺激下的存活率、形态计量学变化和发育进程。虽然两种系统均支持幼虫存活，但3D模型还促进了持续的形态发育。在3D环境中培养的幼虫表现出指示部分发育进程的特征出现，同时其长度和宽度随时间显著增加。相比之下，在2D系统中维持的幼虫虽保持存活，但仅表现出有限且短暂的形态计量学变化。氢化可的松（HC）暴露在两种系统中均增强了幼虫生长，但其在3D模型中的效应更为一致和持续。总体而言，研究结果表明，3D系统提供的条件能够支持幼虫存活以及与部分发育进程一致的形态变化。尽管尚不足以完全支持完整发育，该平台仍代表了朝着开发用于研究粪类圆线虫生物学和病理生物学体外工具迈出的有意义的一步。

一、研究背景与问题

粪类圆线虫病（strongyloidiasis）是一种被忽视的热带病（NTD），由土源性蠕虫粪类圆线虫（Strongyloides stercoralis）引起。世界卫生组织（WHO）近期已将该病纳入需要控制行动的热带病范畴，据估计全球感染人数在3.8亿至6亿之间，主要集中在卫生条件较差的地区。粪类圆线虫的生活史复杂，兼具自由生活阶段和寄生阶段，其寄生阶段包含独特的自体感染循环。感染通过污染土壤中自由生活的感染性第三期幼虫（iL3）经皮肤穿透获得，幼虫随后在人体内迁移并最终定居于小肠，发育为寄生性雌虫。雌虫通过孤雌生殖产生含胚卵，卵孵化为一期杆状幼虫（L1）后随粪便排出体外。然而，部分L1在肠道内蜕皮为丝状iL3，导致自体感染，这一特性使感染可持续终生。自体感染仅发生于人类，在免疫功能正常的动物宿主中不出现。

目前对粪类圆线虫病理生理学的理解大多来源于动物模型，如沙鼠模型和鼠类模型，但缺乏可靠且能准确模拟人肠道微环境的体外模型。尽管二维（2D）和三维（3D）细胞培养系统已被用于研究肠道蠕虫感染对上皮的影响，但能够精确重现人类肠道微环境以支持粪类圆线虫发育的模型仍然缺乏。因此，本研究的目的是探索一种新型体外培养系统，评估2D和3D两种方法是否能支持iL3向寄生周期的发育。

二、研究内容与结论

研究人员开发并评估了一种新型体外培养系统，旨在模拟人类肠道环境以研究粪类圆线虫iL3的生长。研究使用了三个临床分离株（CI1、CI2和CI3），其中两个源自亚洲、一个源自非洲，以纳入自然的生物学和遗传异质性。研究建立了基于Transwell的常规2D共培养系统和基于定制琼脂糖支架的3D模型，后者模拟肠道绒毛微结构。研究设置了对照（CTRL）、氢化可的松（HC）处理共培养、HC处理无细胞以及仅幼虫无细胞等实验条件，在基线（W0）和第4周（W4）通过活体成像评估幼虫存活率、发育进程、形态变化和运动能力。

研究结果表明，两种系统均能维持iL3存活长达4周，但只有3D支架模型促进了持续的形态和表型变化，与部分发育进程一致。3D系统中培养的幼虫出现了可见的生殖原基（genital primordium）和明显的肛门开口（anal opening）等形态特征，且长度和宽度均显著增加。2D系统中的幼虫虽保持存活，但仅表现出有限且短暂的形态变化。HC暴露在两种系统中均增强了幼虫生长，但3D模型中的效应更为持续。此外，3D系统中幼虫的运动能力显著降低，从高度活跃的宿主寻找感染阶段向更受调控的行为状态转变。长期维持实验显示，3D系统中的幼虫可存活长达24周，但初始发育变化后未检测到进一步的形态计量学进展，提示存在发育平台期。

三、主要关键技术方法

研究人员采用的主要关键技术方法包括：基于Transwell的2D共培养系统，其中Caco-2细胞接种于下室而幼虫维持于上室，通过多孔膜限制宿主-寄生虫相互作用仅为可溶性因子；定制3D琼脂糖支架模型，采用牺牲微模塑技术，利用3D打印模具生成具有绒毛样结构的琼脂糖水凝胶支架，支架直径16mm，每个微绒毛样结构高约300μm、宽约500μm、间距300μm，经I型胶原包被后接种Caco-2细胞形成多细胞球体，允许幼虫与细胞聚集体直接物理接触；幼虫激活实验通过荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记评估培养基支持iL3激活的能力；临床分离株基因分型通过扩增线粒体cox1基因和核高变区HVR-I、HVR-IV区域并结合纳米孔测序完成；细胞活力评估采用基于四唑盐XTT的比色法；幼虫形态计量学测量使用Fiji软件（ImageJ 2.14.0版本）的WormBatch宏进行；幼虫运动能力通过视频记录和像素强度波动分析进行量化。临床分离株来源于意大利维罗纳Negrar di Valpolicella的IRCCS Sacro Cuore Don Calabria医院就诊患者的粪便样本。

四、研究结果

1. 1.
   粪类圆线虫iL3激活与基因型：激活实验显示，在Ss-medium中孵育24小时后，CI1和CI3分别约有50%和60%的幼虫被激活，表现为荧光咽部和肠道显现，指示摄食活动恢复。基因分型通过结合线粒体cox1单倍型与核高变区HVR-I和HVR-IV，鉴定出三种基因型。cox1基因鉴定出三个不同的单倍型（H2、H3和H4），每个分离株各检测到一个；HVR-I区域鉴定出基因型II和VI；HVR-IV区域在所有分离株中均分配至基因型A。
2. 2.
   Caco-2细胞表征及药物暴露后的细胞活力：XTT实验显示，24小时时HC在0.1-10μM浓度范围内不影响细胞活力；96小时时HC表现出浓度依赖性效应，浓度≥5μM时细胞活力显著降低（分别为对照水平的54%和34%）。基于此结果，后续实验选择1μM HC以避免长时间暴露后的细胞毒性效应。
3. 3.
   2D与3D培养系统的形态学分析：两种系统中培养的幼虫均发育出钝尾形态，与新鲜分离iL3典型的双叉尾不同。然而，仅3D模型中培养的幼虫表现出额外的发育进展指示特征，包括可见的生殖原基和明显的肛门开口。这些形态特征在3D系统W4时检查的所有幼虫中均观察到（对照组33/33，HC处理组26/26）。运动能力方面，新鲜分离的iL3和2D系统中的幼虫表现为快速、不规则运动，而3D系统中的幼虫表现为较慢、更蜿蜒且协调的运动。定量分析显示，2D系统中iL3的平均运动指数为128.6 a.u.，而3D系统中为67.7 a.u.，约降低1.8倍。
4. 4.
   2D培养系统中的幼虫形态计量学分析：在2D共培养系统中，对照条件下W4时幼虫长度较基线显著增加（p=0.0002），但宽度无显著变化。HC处理组W4时长度较基线显著增加（p<0.0001），宽度仍无显著变化。在无细胞对照组（HC-nocells和no-cells）中，与基线相比未观察到长度和宽度的显著差异。
5. 5.
   3D培养系统中的幼虫形态计量学分析：3D系统中对照条件下W4时幼虫长度和宽度均较基线显著增加（p<0.0001）。HC处理组W4时长度和宽度同样较基线显著增加（p<0.0001）。无细胞条件下未观察到显著生长。长期维持实验显示，两个临床分离株在3D系统中可存活长达24周，但初始变化后未检测到进一步的形态计量学进展，提示发育平台期。
6. 6.
   2D与3D系统的幼虫形态计量学比较：对照条件下，3D系统中幼虫显著宽于2D系统（p=0.001）。HC刺激条件下，3D系统中幼虫的长度和宽度均显著大于2D系统（p=0.002和p<0.0001）。

五、讨论与结论

研究结果表明，3D系统为粪类圆线虫发育提供了支持性环境，可能代表研究宿主-寄生虫相互作用的有前景的模型。在3D系统中观察到的形态学标志类似于粪类圆线虫发育过程中描述的前青春期阶段，并与自体感染L4期具有共同特征，提示3D系统可能提供了更接近体内肠道微环境的线索。HC单独作用不足以诱导幼虫大小可测量的增加，无细胞条件下也未观察到显著变化，表明形态计量学变化不能仅归因于HC。2D和3D系统不仅在空间结构上不同，还在幼虫与上皮细胞的物理关系上存在差异：2D系统中幼虫与Caco-2细胞物理分离，而3D系统允许直接接触，因此目前无法区分支架结构和直接幼虫-细胞相互作用的相对贡献。

研究存在一些局限性：使用临床分离株而非实验室适应株，虽然代表了自然生物学变异性，但获得足够数量活力和无菌幼虫具有挑战性，限制了实验可扩展性和可重复性；HC处理条件仅使用一个临床分离株（CI1）评估；由于幼虫数量有限，每个条件和分离株仅纳入一个孔进行形态计量学分析，统计比较使用个体幼虫测量值而未考虑孔内或分离株内的聚类效应，报告的p值应视为探索性；测量在活体幼虫上进行，因幼虫运动、方向和成像条件引入了较高变异性；3D支架仍是肠道环境的简化模型，缺乏免疫细胞、微生物群和复杂生化梯度等关键组分。

总体而言，3D系统虽尚不支持完整的体外发育，但提供了比常规方法更相关的环境。3D微环境促进了常规2D条件下未观察到的形态特征，这些特征类似于感染性幼虫向寄生阶段过渡期间描述的中间发育形式。未来研究将整合更复杂的共培养条件（如人肠道类器官）和更大样本量，以扩展观察结果并支持粪类圆线虫生长，最终为理解类圆线虫病机制、药物筛选和寄生虫发育机制研究提供关键创新方法，同时减少对动物模型的依赖。