《Horticulturae》：Integrated Transcriptomic and Metabolomic Analyses Identify Candidate Genes and Pathways in Adventitious Rooting of Macadamia Cuttings
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澳洲坚果（Macadamia integrifolia）是一种具有重要经济价值的热带和亚热带作物，但其大规模繁殖仍受限于不定根形成困难。‘桂热1号’（‘Guire 1’）是中国广西的主导栽培品种，占当地种植面积的65%以上，但其生根能力及潜在调控机制仍知之甚少
澳洲坚果（Macadamia integrifolia）是一种具有重要经济价值的热带和亚热带作物，但其大规模繁殖仍受限于不定根形成困难。‘桂热1号’（‘Guire 1’）是中国广西的主导栽培品种，占当地种植面积的65%以上，但其生根能力及潜在调控机制仍知之甚少。研究人员以‘桂热1号’一年生木质化枝条为材料，在生根过程中检测了结构、生理和分子特征。测量内容包括生根各发育阶段的养分含量、氧化酶活性和内源激素水平，同时开展转录组与代谢组整合分析以鉴定关键通路和基因。结果表明，澳洲坚果插穗通过愈伤组织形成途径生根。在生根过程中，丙二醛（MDA）、可溶性糖和可溶性蛋白含量逐渐下降，后期无显著变化。超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性逐渐降低，其中过氧化物酶在后期保持相对较高活性。游离脯氨酸、脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）含量在早期达到峰值后下降，而吲哚-3-乙酸（IAA）在根原基起始阶段达到峰值。玉米素核苷（ZR）和水杨酸（SA）在初始阶段含量最高。在生根过程中，共鉴定出1722个差异代谢物（DAMs）、14482个差异表达基因（DEGs）和699个转录因子。整合分析确定植物激素信号转导、苯丙烷生物合成、黄酮类生物合成以及淀粉和蔗糖代谢为参与澳洲坚果插穗生根的关键通路。这些通路在生根过程中调控激素平衡、木质素合成、维管分化、活性氧清除和能量供应。该研究阐明了澳洲坚果插穗的生根机制，为种质资源保存和规模化繁殖技术提供了理论支持。
论文解读：澳洲坚果扦插不定根形成的生理与分子调控机制
一、研究背景与科学问题
澳洲坚果（Macadamia integrifolia）又名昆士兰坚果或夏威夷果，是一种原产于澳大利亚东南部的多年生常绿乔木，因其果仁营养价值极高而被广泛誉为“坚果之王”。其果仁含70%–80%的脂肪，其中约78%为不饱和脂肪酸，并富含生育酚、三烯生育酚、植物甾醇和角鲨烯等生物活性化合物。中国已成为全球主要的澳洲坚果生产国，广西、云南和贵州等省份占种植面积的大部分。然而，优质苗木供应仍是产业扩张的关键瓶颈。
澳洲坚果苗木通常采用嫁接繁殖，但这一过程耗时且复杂。嫁接常因伤口快速流胶导致成活率低，流胶在物理上阻碍了砧木与接穗之间维管连接的建立；此外，澳洲坚果木材坚硬易碎且单宁含量高，也增加了嫁接难度。相比之下，扦插繁殖提供了一种更简单、更快速的繁殖方法，可缩短育苗周期、降低成本并保持优良亲本性状。然而，澳洲坚果品种普遍表现出较低且不稳定的生根能力。对32个基因型的调查发现，M. integrifolia的成活率仅为54%，而M. tetraphylla为84%，M. integrifolia × M. tetraphylla杂交种为79%。扦插繁殖的成功取决于不定根形成，这是一个复杂的发育过程，受激素、氧化酶和养分储备的协同调控。
尽管前期研究已改良了澳洲坚果扦插技术和生根率，但澳洲坚果插穗不定根形成的内在机制仍不清楚，特别是生理性状的动态变化和分子调控网络。在同一品种内整合解剖学、生理学和分子数据的综合分析尤为缺乏。为填补这一空白，本研究以‘桂热1号’品种的完全木质化枝条为实验材料，系统检测了生根过程中插穗基部的内源激素、养分和氧化酶活性的时间变化，并结合解剖学观察以及四个阶段（S0、S1、S2和S3）的转录组与代谢组整合分析，鉴定与不定根发育相关的关键通路和候选基因，为提升澳洲坚果扦插繁殖效率提供分子基础。
二、主要关键技术方法
研究人员在贵州省亚热带作物研究所温室中开展扦插实验，以‘桂热1号’一年生木质化枝条为材料，经0.1%高锰酸钾消毒、2.0 g/L IBA和0.50 g/L NAA速蘸处理后插入沙床。在扦插后0 d（S0）、20 d（S1）、40 d（S2）和80 d（S3）四个时间点采集插穗基部韧皮部和愈伤组织混合样品，每个时间点三个生物学重复。研究采用石蜡切片技术进行解剖学观察；利用商业试剂盒测定MDA、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、IAA、ABA、ZR、SA、JA含量及SOD和POD活性；基于Illumina HiSeq平台进行转录组测序，以M. integrifolia参考基因组（品种HAES 741；assembly SCU_Mint_v3；GCF_013358625.1）为参考进行比对，使用DESeq2筛选差异表达基因（DEGs）；采用LC-MS/MS进行代谢组学分析，以多反应监测（MRM）模式检测代谢物；最后对DEGs和差异代谢物（DAMs）进行KEGG通路联合富集分析，筛选核心调控通路。
三、研究结果
3.1 生根表型与形态学观察
形态观察显示，S0阶段插穗切口干净平滑；S1阶段基部出现少量微白色愈伤组织；S2阶段愈伤组织体积显著增大并呈白色，此时插穗内部已诱导形成不定根原基；S3阶段白色芽状不定根从愈伤组织中伸出，形成明显的根结构。观察结果表明，澳洲坚果插穗遵循依赖愈伤组织的生根模式，整个过程大致包括三个阶段：愈伤组织形成阶段（S1）、根原基起始阶段（S2）和根原基伸长与出土阶段（S3）。
3.2 解剖学特征
石蜡切片观察显示，S0阶段插穗基部横纵切面组织层次清晰，由内向外依次为髓、髓射线、木质部、形成层、韧皮部、皮层和表皮。S1阶段皮层内细胞分裂明显，细胞数量增加，皮层与表皮之间出现突出的愈伤组织结构。S2阶段构成愈伤组织的薄壁细胞持续增殖，部分细胞分化形成新的木质部和形成层，另一部分特化发育为起源于愈伤组织的根原基，显微照片中可见清晰的泪滴状细胞团。S3阶段根原基内分生组织细胞通过增殖、扩张和特化形成根冠，根原基基部区域伸长，最终突破表皮形成完整的不定根。
3.3 生根过程中生理参数的变化
MDA含量在生根过程中逐渐下降，S3阶段较S0显著降低38.54%。总可溶性糖和可溶性蛋白含量均逐渐下降，S3阶段较S0分别显著降低20.93%和33.69%。游离脯氨酸含量先升后降，S1阶段较S0增加18.28%，随后逐渐下降。SOD活性在生根过程中逐渐下降，S3阶段较S0显著降低60.09%；POD活性也呈下降趋势，S0最高，S3最低。内源激素方面，IAA含量先升后降，S2阶段达到峰值，为S0的23.12倍；ABA含量先升后降，S1达到峰值后逐渐下降；ZR和SA含量先降后升，S0最高，S2最低，S3有所回升；JA含量持续下降，S3较S0显著降低88.15%。
3.4 转录组分析
转录组测序共鉴定出30692个已知基因和1258个推定新基因。PCA分析显示PC1和PC2分别解释34.91%和22.74%的总方差，各阶段样品明显分离，生物学重复紧密聚类（R2 > 0.88）。以|log?FC| ≥ 1和p < 0.05为阈值，S0 vs. S1比较获得7349个DEGs（3127个上调，4222个下调）；S1 vs. S2获得4641个DEGs（2532个上调，2109个下调）；S2 vs. S3获得2492个DEGs（1551个上调，941个下调）。三个比较组共有703个DEGs。KEGG富集分析分别鉴定出83、82和54条显著富集通路，排名前列的通路包括植物激素信号转导、辅因子生物合成、MAPK信号通路-植物、苯丙烷生物合成、淀粉和蔗糖代谢以及黄酮类生物合成，其中37条通路在三个比较组中共同富集。共鉴定出699个转录因子，主要家族为ERF、MYB、NAC和bHLH，分别有12、7、6和5个成员在三个比较组中均差异表达。
3.5 代谢组分析
代谢组学共检测到2749个代谢物，其中87个具有明确生物学功能，主要分为脂质（20）、肽类（19）、类固醇（13）、碳水化合物（11）、维生素和辅因子（9）、有机酸（8）、核酸（6）和抗生素（1）八大类。含量最高的20个代谢物主要包括奎宁酸、4,6-O-亚乙基-α-D-葡萄糖、亚油酰胺、(E,Z)-10,12-十六碳二烯醇、柠檬酸、L-苹果酸、儿茶素和没食子儿茶素。以|log?FC| > 1和p < 0.05为阈值，共鉴定出1722个DAMs，其中S0 vs. S1有773个（399个上调，374个下调），S1 vs. S2有533个（222个上调，311个下调），S2 vs. S3有416个（169个上调，247个下调），三个比较组共有63个DAMs。KEGG富集分析显示，三个比较组分别有37、34和34条显著富集通路，主要涉及氨基酸生物合成、核苷酸代谢、嘌呤代谢、黄酮类生物合成、苯丙氨酸代谢和苯丙烷生物合成，其中22条通路共同富集。
3.6 DEGs与DAMs联合分析
联合分析确定了四个与澳洲坚果插穗生根可能相关的核心通路。植物激素信号转导通路中，IAA与TIR1/AFB受体结合促进AUX/IAA降解，释放ARF转录因子激活下游基因；ARF在S0、S2和S3高表达，GH3仅在S1高表达，SAUR在S2高表达。细胞分裂素信号通路中，AHK在S1上调，B-ARR和A-ARR在S2和S3表达升高。赤霉素信号通路中，GID1在S0上调，DELLA在早期下调、后期上调，PIF在S1上升。ABA信号通路中，PYL在S2和S3高表达，PP2C在S0和S1上调、S2和S3下调。JA通路中，JAZ在后期表达升高，MYC2在S0显著上调。SA通路中，TGA和PR在S0高表达。苯丙烷生物合成通路中，PAL和PTAL在S0和S1高表达，4CL在S1相对较高，CCR和CAD在S0和S3显著上调，UGT72E在S3显著增加，阿魏酸和芥子酸在S2显著积累，丁香苷和甲基丁香酚在S2和S3积累。黄酮类生物合成通路中，CHS和F3H在S3高表达，FLS和DFR在S1高于S3，HCT、CYP98A、CYP75B1、LAR和ANR在S0高表达；黄烷酮在S1积累较多，黄酮醇槲皮素在S0较丰富，花青素在S2和S3积累较高，黄烷-3-醇在S0和S1较多。淀粉和蔗糖代谢通路中，INV在S0和S3上调，HXK在S1增加，glgC和glgA在早期上调、后期下调，GBE1在S1和S2显著上调，SUS和SPS在S0和S1显著上调，海藻糖-6P在S0积累较高，海藻糖在S2显著增加。
四、讨论与结论
讨论部分指出，澳洲坚果插穗的不定根起源于插穗基部的愈伤组织，根原基主要从维管形成层外侧的薄壁细胞分化而来，维管形成层是不定根原基的主要和最直接来源，邻近形成层的韧皮部薄壁细胞也有少量贡献。生理方面，可溶性糖和可溶性蛋白在生根过程中优先分配以支持愈伤组织发育和根起始；脯氨酸在早期积累为伤口愈合和根原基初始形成提供稳定的水分微环境，后期降解为根生长提供氮和碳骨架。POD和SOD活性在S0最高以应对伤口诱导的氧化应激，S1的快速下降有利于愈伤组织形成，后期POD参与木质素合成以支持根伸长。激素方面，高浓度IAA为根起始所必需，低浓度有利于根伸长；ABA在早期增强胁迫耐受，后期下降促进根伸长；ZR从S0到S2持续下降有利于根原基起始，S3回升支持根生长；低SA水平有利于愈伤形成和根诱导；低JA浓度有利于生根。分子层面，植物激素信号转导通路通过阶段特异性转录模式协调生根各阶段；苯丙烷生物合成通路通过木质素沉积增强细胞壁机械强度；黄酮类生物合成通路通过清除活性氧和调节生长素积累影响生根；淀粉和蔗糖代谢通路在早期优先提供糖酵解能量，后期转向能量储存和结构前体积累。
研究结论为：本研究全面考察了‘桂热1号’插穗不定根形成过程中的生理、代谢和分子变化。生根过程被定性为愈伤组织介导型，包含愈伤组织形成、根原基起始和根原基伸长与出土三个阶段。整合转录组和代谢组分析鉴定出1722个DAMs、14482个DEGs和699个转录因子，揭示植物激素信号转导、苯丙烷生物合成、黄酮类生物合成以及淀粉和蔗糖代谢是该品种不定根形成的核心协同调控通路。激素信号协调阶段特异性的生根事件；苯丙烷通路促进木质素沉积以强化细胞壁；黄酮类通路缓解氧化胁迫并调节生长素积累；淀粉和蔗糖代谢维持整个生根过程的能量供应。这些通路共同构成一个整合的调控网络模型，为理解‘桂热1号’不定根形成的分子机制提供了有价值的起点。该研究结果为澳洲坚果种质资源保存和规模化繁殖技术提供了理论支持。
