墨西哥锡那罗亚州药用植物总酚含量与抗氧化活性相关且独立于初步毒性：多变量整合分析

《Applied Biological Chemistry》：Total phenolic content is associated with antioxidant activity independently of preliminary toxicity in medicinal plants from Sinaloa, Mexico: a multivariate approach

　　

墨西哥锡那罗亚州的药用植物区系被农村和高地社区广泛使用；然而，关于其植物化学轮廓、抗氧化能力和毒理学安全性的科学信息仍然稀少且零散。本研究评估了来自15种原生药用植物的20个乙醇提取物的定性植物化学轮廓、总酚含量（Folin–Ciocalteu法）、体外抗氧化能力（DPPH、ABTS和FRAP法）以及初步毒性（Artemia salina致死试验）之间的关系，采用整合性多变量统计方法（Spearman相关、层次聚类、因子分析混合数据（FAMD）、偏最小二乘回归（PLS）和置换多元方差分析（PERMANOVA））。结果发现总酚含量与抗氧化活性之间存在非常强的正关联（ρ=0.72–0.92；校正p<0.005），并在所有分析途径中一致得到确认。由于Folin–Ciocalteu法量化的是总还原能力而非仅酚类化合物，该关联被解释为还原能力与自由基清除活性之间的定量关系，而非特定结构类别的证据。相反，定性植物化学筛选对抗氧化活性没有预测能力（η²<0.05；PERMANOVA，R²≤0.033）。Arbutus bicolor和Eysenhardtia polystachya提取物被鉴定为具有最高抗氧化潜力的提取物。初步毒性与抗氧化活性表现出功能独立性（ρ≈0）。A. bicolor的数据构成了对该物种（原产于西马德雷山脉）抗氧化能力和初步毒性的首个定量证据。所采用的多变量方法为区域药用植物区系的系统探索提供了可重复的分析框架，并将A. bicolor和E. polystachya确定为色谱表征（HPLC-DAD，LC–MS/MS）的优先候选。

研究背景与问题：氧化应激（活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生与抗氧化防御失衡）与癌症、心血管疾病、糖尿病和神经退行性疾病等慢性退行性疾病病理生理相关。天然抗氧化物的寻找受到关注，但植物提取物的抗氧化活性并非仅由某一类化合物决定，而受多代谢物相互作用、物种、器官和环境条件影响。墨西哥是民族植物学多样性中心，锡那罗亚州植物区系丰富且特有性强，但其药用植物区系研究少，植物化学轮廓、抗氧化能力和毒理学安全性信息稀缺且零散；现有研究多针对其他地区种群，且常将植物化学、抗氧化活性或毒性割裂评价，缺少在同一分析框架内同时整合这些维度的评价。因此，研究人员开展本研究，以评估锡那罗亚州15种原生药用植物20个乙醇提取物的定性植物化学轮廓、总酚含量、体外抗氧化能力和初步毒性之间的关系，并识别高生物潜力提取物及植物化学与生物活性变量的关联结构，为区域药理研究提供方向。

研究开展与意义：研究人员采用整合性多变量统计方法，发现总酚含量与抗氧化活性呈非常强正关联，且该关联在多种分析中一致；定性植物化学筛选则无预测能力；A. bicolor和E. polystachya具有最高抗氧化潜力；初步毒性与抗氧化活性功能独立。A. bicolor数据为该原生种首次定量抗氧化与初步毒性证据。该多变量框架为区域药用植物系统探索提供可复制模型，并将A. bicolor和E. polystachya列为HPLC-DAD或LC–MS/MS色谱表征及生物测定引导分级的优先候选。

关键技术方法：研究人员采集锡那罗亚州7个市（Culiacán、Badiraguato、Concordia、Mocorito、Guasave、Ahome、El Rosario）2023年3月至2024年11月的15种12科原生药用植物，制成20个乙醇提取物，凭证标本存于UAS农学院和Culiacán植物园标本馆。以Folin–Ciocalteu法测总还原能力，DPPH、ABTS和FRAP法测体外抗氧化能力，Artemia salina致死试验评估初步毒性，并进行定性植物化学筛选；采用Spearman相关、层次聚类、Kruskal–Wallis/Dunn、PERMANOVA、FAMD和PLS分析，R 4.5.0与SPSS 26完成统计。

研究结果：
1. 提取率（Extraction yield）：20个乙醇提取物得率为11.72%–82.16%（M=30.54%，SD=19.64）；A. bicolor（EMN）最高（82.16%），Juglans major（ENG，69.95%）、Rhus aromatica（EAG，49.81%）、H. latiflora树皮（ECPC，49.45%）次之；H. hartwegianum根（ETR，11.72%）最低，显示组织组成和可提取性异质。
2. 定性植物化学轮廓（Qualitative phytochemical profile）：酚类（19/20，95%）和萜类（18/20，90%）最常见，黄酮15/20（75%）、鞣质11/20（55%）、生物碱5/20（25%）、皂苷2/20（10%）；R. aromatica（EAG）定性多样性最高，H. hartwegianum叶（ETH）最窄；H. hartwegianum根（ETR）与叶（ETH）器官间差异明显；E. polystachya（EPA）黄酮阴性及部分“+”酚类提取物总酚高，提示序数类别反映显色可检出性而非浓度。
3. 总酚含量（Total phenolic content）：以总还原能力表示，范围6.70–123.53 μg GAE/mL（M=33.68，SD=28.61）；A. bicolor（EMN）最高（123.53 μg GAE/mL），E. polystachya（EPA，76.05）、H. patens（EOR，62.10）、H. latiflora树皮（ECPC，58.76）较高；A. ambrosioides根（ECR，6.70）和H. hartwegianum叶（ETH，9.02）最低。
4. 体外抗氧化能力（In vitro antioxidant capacity）：A. bicolor（EMN）三项最高：DPPH 124.72、ABTS 185.08、FRAP 241.89 μg TE/mL；E. polystachya（EPA）次之（100.00、178.38、195.90 μg TE/mL）；DPPH范围6.46–124.72，ABTS 0.90–185.08，FRAP 6.54–241.89 μg TE/mL；S. ferrugineum（ESM）FRAP 91.00 μg TE/mL且LD₅₀=2401 μg/mL。
5. 初步毒性（Preliminary toxicity）：LD₅₀范围78–2561 μg/mL（M=986.65，SD=826.92）；按伊比利亚美洲科技发展计划（CYTED）分类，H. patens（EOR，78 μg/mL）唯一高毒；7个中等毒（含EAG 138、EPA 148、ETJ 166 μg/mL）；3个轻毒、3个 practicamente non-toxic、6个relatively harmless；ECPC 2561、ESM 2401、EPV 2184 μg/mL较高。
6. 正态性评估与相关分析（Normality assessment and correlation analysis）：Shapiro–Wilk显示所有定量变量偏离正态（W=0.716–0.887；p<0.05）；DPPH、ABTS、FRAP间ρ=0.65–0.69；三者与总酚含量（GAE）ρ=0.72–0.92；提取率与抗氧化变量ρ=0.15–0.38；LD₅₀与抗氧化变量ρ≈0。
7. 多变量组织分析（热图，Multivariate organization analysis）：层次聚类热图显示EMN和EPA形成抗氧化变量与GAE高值区块，其余提取物异质；变量水平DPPH、FRAP、ABTS和GAE聚类一致，定性植物化学变量分散，LD₅₀呈横向分布而不与抗氧化变量或特定簇关联。
8. 非参数分析（Non-parametric analyses）：Kruskal–Wallis未发现复合抗氧化指数在酚类（χ²(3)=3.06，p=0.382）、黄酮（χ²(3)=0.77，p=0.858）、鞣质（χ²(2)=2.35，p=0.309）水平间有显著差异；Dunn事后比较均无显著（校正p≥0.978；|Z|≤0.70），效应量低（η²<0.05）；PERMANOVA无显著多元效应（酚类pseudo-F(1,16)=0.11，p=0.863，R²=0.006；黄酮0.22，p=0.727，R²=0.013；鞣质0.56，p=0.491，R²=0.033），betadisper未检出组内离散异质性。
9. 因子分析混合数据（FAMD）：前两维解释35.5%总方差（Dim1=20.2%，Dim2=15.3%），前五维累计65.8%；Dim1主要由DPPH、ABTS、FRAP和GAE定义，Dim2主要与LD₅₀及其分类及特定定性变量相关；未见由毒性类别定义的离散簇，提取物连续分布且类别重叠。
10. 多变量建模（PLS）：全模型含GAE时，GAE对第一潜成分贡献最高并与抗氧化响应一致；R²X=0.17，R²Y=0.91；两个模型最优组分数均为1，无法估计累积Q²；bootstrap 95%置信区间所有载荷包含零；排除GAE的结构模型中抗氧化响应聚于第一成分，定性变量投影于第二维，萜类和皂苷方向相反；VIP仅萜类（1.71）和生物碱（1.12）>1，但稳定性低，仅作描述性指标。

讨论部分总结：中心发现是总酚含量与抗氧化能力非常强正关联，且Spearman相关、层次聚类、FAMD和PLS多方法收敛；但Folin–Ciocalteu法测总还原能力，Everette et al.、Sánchez-Rangel et al.和Rumpf et al.指出其受非酚还原物干扰并与FRAP、ABTS共享单电子转移机制，因此部分相关属化学预期，不能证明酚类因果，需色谱定量确认。三种抗氧化法相关支持内部一致性。定性筛选无预测力，因只反映存在而非浓度；H. latiflora树皮ECPC酚类仅“+”但总酚高，与4-苯基香豆素反应较弱有关；E. polystachya（EPA）黄酮阴性可由Shinoda试验依赖4-氧代-2-苯基色酮核而Coatline B为C-葡萄糖基二氢查尔酮解释，属可预期假阴性。建议以类特异性定量和色谱替代或补充序数筛选。A. bicolor（EMN）与E. polystachya（EPA）一致最高；Br?i? Kara?onji et al.、Buzgaia et al.、Doudach et al.、Demir et al.支持Arbutus属植物化学丰富，Molina et al.、Parra-Espejel et al.、Estrada Castillón et al.支持E. polystachya酚类丰富。LD₅₀与抗氧化独立；Artemia salina试验仅为无脊椎动物初步细胞毒筛选，不能推断哺乳动物毒性或人用安全性；Cristians et al.、Cervantes-Valencia et al.的啮齿类数据说明其与Artemia结果不可互推。H. hartwegianum器官差异显著，根ETR含酚类+++、鞣质++、黄酮++，叶ETH仅萜类+++和皂苷+，Velasco-Azorsa et al.对近缘种有相关报道。局限包括n=20、单复合采集单次提取、非生物重复、定性序数、Folin非结构特异、单一溶剂极性及毒性仅无脊椎动物；PLS为探索性协变近似。未来优先对A. bicolor、E. polystachya及H. hartwegianum行HPLC-DAD/LC–MS/MS、生物测定引导分级和代谢组学，并纳入独立采集与提取、不同极性部位及细胞/动物模型验证。

研究结论（原文结论翻译）：在20个乙醇提取物中，抗氧化活性变异沿总酚含量定量梯度组织，而特定代谢物类别的定性存在无解释价值；Spearman相关、层次聚类、FAMD、PERMANOVA及PLS等不同假设的分析方法汇聚于此结果。由于Folin–Ciocalteu法测总还原能力，该发现最宜表述为还原能力与自由基清除活性之间的关联，其结构解释需色谱确认。生物勘探的实际意义直接：序数筛选不足以作为提取物优先选择标准，应以类特异性定量或仪器分析替代。Arbutus bicolor和Eysenhardtia polystachya提取物一致最高，A. bicolor数据为该西马德雷山脉原生种抗氧化能力与初步毒性的首个定量证据，二者均为HPLC-DAD或LC–MS/MS轮廓分析与生物测定引导分级的优先候选。仅由Artemia salina致死试验评估的初步毒性在所有分析中独立于抗氧化活性，表明二者由不同机制介导，选择物种时不能相互预测；该结果不涉及哺乳动物毒性或人类安全。整合分类与连续变量的多变量框架为区域药用植物系统探索提供可复制模型，H. hartwegianum显著器官依赖变异使其适合作为生物测定引导分离的模型。