《Genes》：Mining of L-Type LecRK Genes and Characterization of MtLecRKs with Their Regulatory Elements Related to Stress Resistance in Medicago truncatula
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背景/目的：生物胁迫和非生物胁迫对全球农业产生负面影响，降低作物产量。L型LecRLKs（L-type LecRLKs）是植物受体样激酶（receptor-like kinases，RLKs）蛋白家族中的一个重要亚群，有助于植物抵抗多种生物和非生物胁迫。然而，
背景/目的：生物胁迫和非生物胁迫对全球农业产生负面影响，降低作物产量。L型LecRLKs（L-type LecRLKs）是植物受体样激酶（receptor-like kinases，RLKs）蛋白家族中的一个重要亚群，有助于植物抵抗多种生物和非生物胁迫。然而，在模式植物蒺藜苜蓿（M. truncatula）中，L型LecRLK（L-type LecRLK）基因的全基因组鉴定及其调控元件特征尚未被研究。方法：这项综合性生物信息学研究在蒺藜苜蓿中鉴定了L型MtLecRLK（L-type MtLecRLK）候选基因，并通过系统发育分析、结构域和基因结构分析、亚细胞定位预测、基因重复和染色体分布分析、Ka/Ks比值计算、顺式调控元件（cis-regulatory elements）、转录因子、基因本体论（gene ontology，GO）术语和microRNA靶标鉴定，以及表达数据分析对其进行了表征。结果：分析揭示了蒺藜苜蓿中存在40个L型MtLecRLK候选基因。系统发育分析将这些基因分为六组（I–VI），并显示了拟南芥（A. thaliana）、大豆和蒺藜苜蓿之间的进化关系。MtLecRLKs的结构域和基因结构分析揭示了一个保守的lectin_legB结构域，该结构域此前已被认为与胁迫耐受性相关，并显示82.5%的MtLecRLKs缺乏内含子。根据亚细胞定位分析，MtLecRLKs在质膜中含量丰富。MtLecRLKs的基因重复和染色体结果揭示，片段重复和串联重复都可能促进家族扩展，而Ka/Ks比值分析表明这些基因可能经历强烈的纯化选择。研究鉴定了顺式元件MYB、WRKY和ABRE；转录因子CPP和G2-like；基因本体论术语胁迫响应；以及microRNAs mtr-miR2089、mtr-miR2118和mtr-miR5558，并且表达数据显示35%的MtLecRLKs过度表达，相关分析发现这些基因在各种胁迫响应中发挥作用。结论：这些发现提出了与蒺藜苜蓿研究中的胁迫适应相关的有前景的候选基因，并揭示了植物中L型LecRLKs的进化和功能多样性。
蒺藜苜蓿L型凝集素受体样激酶基因家族的全基因组鉴定与抗逆调控网络解析
一、研究背景与科学问题
植物在其整个生长发育过程中面临多种胁迫，需要强大的适应系统来确保生存和生产力。每年，由多种昆虫和病原生物引起的生物胁迫导致农业产量下降20%–40%，造成2900亿美元的经济损失。非生物胁迫（包括高温或低温、涝渍、干旱和过度盐碱）影响植物生长、发育和生理，每年导致全球51%–82%的作物产量损失，仅盐胁迫就造成273亿美元的经济损失。凝集素（lectins）通过结合特定碳水化合物结构激活植物内部防御机制，参与脱落酸（abscisic acid，ABA）介导的胁迫响应，帮助植物应对干旱、盐碱、极端温度和病原攻击等多种胁迫。植物细胞表面的模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）定位于质膜，可检测病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），激活PAMP触发免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）。凝集素受体样激酶（lectin receptor-like kinases，LecRLKs）是植物特异性受体样激酶（receptor-like kinases，RLKs）的一个亚家族，根据其胞外凝集素结构域和进化关系分为C型、L型和G型三个亚群，对植物生长发育及生物和非生物胁迫响应至关重要。尽管拟南芥、水稻、杨树、桉树、大豆、本氏烟、马铃薯、黄瓜和番茄等物种中已开展了LecRLK基因家族的全基因组研究，但作为豆科模式植物的蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中L型LecRLK基因及其调控元件尚未被系统鉴定。蒺藜苜蓿是研究固氮根瘤菌与豆科植物相互作用的参考植物，广泛用于叶片和花发育、开花时间调控、昆虫真菌细菌互作及耐旱性研究。因此，本研究旨在系统挖掘蒺藜苜蓿L型LecRLK基因，为其抗逆品种改良提供基因资源。
二、主要技术方法
研究人员利用Phytozome数据库（基因组ID：285）获取蒺藜苜蓿Mt4.0v1蛋白组和基因组序列，以60个大豆L型GmLecRLK蛋白序列为查询序列，通过蛋白-蛋白BLAST（BLASTP）进行同源搜索，以一致性≥63%和E值0.0为筛选阈值，鉴定出40个L型MtLecRLK候选基因。随后采用Clustal-W多重序列比对和MEGA11最大似然法（maximum-likelihood，ML）构建系统发育树（1000次自举重复）；利用NCBI保守结构域数据库（CDD）和TBtools进行结构域分析；使用基因结构显示服务器（GSDS 2.0）分析外显子-内含子结构；通过WoLF PSORT预测亚细胞定位；利用MG2C工具可视化染色体位置；采用TBtools的Advanced Circos插件和One Step MCScanX工具分析基因重复事件和共线性关系，并计算Ka/Ks比值；通过PLACE数据库鉴定顺式调控元件；利用植物转录因子数据库（plantTFDB v4.0）预测转录因子；通过DeepGOWeb进行基因本体论（GO）注释；使用植物miRNA百科全书（PmiREN）和psRNATarget预测miRNA靶标；基于NCBI GEO数据库的GSE173197和GSE121969数据集进行盐胁迫下的基因和miRNA表达分析。
三、研究结果
3.1 MtLecRLK蛋白的鉴定
研究人员从蒺藜苜蓿蛋白组中鉴定出40个L型MtLecRLK蛋白，将其命名为MtLecRLK_1a至MtLecRLK_6l，分属六个组（I–VI）。系统发育分析揭示了拟南芥、大豆和蒺藜苜蓿LecRLK蛋白的进化关系。MtLecRLK蛋白长度范围为365（MtLecRLK_2b）至1380（MtLecRLK_4c）个氨基酸，等电点（pI）范围为酸性5.43（MtLecRLK_3g）至碱性8.61（MtLecRLK_6h），脂肪族指数范围为81.19至96.5，总平均亲水性（GRAVY）范围为?0.302至?0.058。
3.2 MtLecRLKs的特征分析
3.2.1 结构域和结构分析
所有MtLecRLK蛋白均含有保守的lectin_legB结构域和PK_Tyr_Ser-Thr超家族结构域。部分蛋白还富集其他结构域，如MtLecRLK_1c含Lectin_legB超家族、MtLecRLK_3c含SKG6超家族、MtLecRLK_3f和MtLecRLK_3i含HSP20超家族。基因结构分析显示，40个MtLecRLK基因中有33个（82.5%）仅含一个外显子（无内含子）；MtLecRLK_1d、MtLecRLK_2d、MtLecRLK_3f和MtLecRLK_5a含两个外显子；MtLecRLK_5c和MtLecRLK_6h含三个外显子；MtLecRLK_3i含四个外显子。
3.2.2 MtLecRLK蛋白的亚细胞和染色体定位
亚细胞定位预测显示，大多数MtLecRLK蛋白与质膜、液泡膜和内质网最为邻近，部分蛋白与胞外空间、细胞核、细胞质、细胞骨架、线粒体、高尔基体和过氧化物酶体邻近。40个MtLecRLK蛋白分布于蒺藜苜蓿8条染色体中的7条，其中15个（37.5%）位于7号染色体。染色体4、7和scaffold0015上存在MtLecRLK的串联重复。
3.2.3 MtLecRLKs的基因重复事件
通过One Step MCScanX工具共发现11对重复基因对，涉及22个MtLecRLK基因（占家族的55%），包括3对片段重复（MtLecRLK1a–MtLecRLK1b、MtLecRLK1d–MtLecRLK1e、MtLecRLK6f–MtLecRLK6g）和8对串联重复（MtLecRLK2a–MtLecRLK2b、MtLecRLK3c–MtLecRLK3d、MtLecRLK3h–MtLecRLK3i、MtLecRLK4c–MtLecRLK4d、MtLecRLK5c–MtLecRLK5d、MtLecRLK6a–MtLecRLK6b、MtLecRLK6c–MtLecRLK6d、MtLecRLK6h–MtLecRLK6i）。所有重复基因对的Ka/Ks比值介于0.238851至0.693794之间，均小于1，表明这些基因可能经历强烈的纯化选择。
3.2.4 MtLecRLK基因的顺式调控元件
顺式作用调控元件（CAREs）分析发现多个胁迫相关元件，包括MYB、MYC、CRT、GCCcore、PR、ERE、WRKY、Wbox、CBF因子、LTRE、CURE、ANAERO、SURE、DRE、ERD和ABRE元件。大多数MtLecRLK基因与MYB、MYC、W-box、WRKY、ERD和ABRE元件高度相关，与ERE、CURE、SURE、ANAERO和LTRE元件中度相关。
3.2.5 MtLecRLK蛋白的转录因子和基因本体论分析
转录因子预测发现，除MtLecRLK_1d、MtLecRLK_1f、MtLecRLK_2d和MtLecRLK_4b–4d外，大多数MtLecRLK与CPP家族蛋白相关；12个MtLecRLK（包括MtLecRLK_2a–2c、MtLecRLK_3a、MtLecRLK_4a、MtLecRLK_6a–6e、MtLecRLK_6h和MtLecRLK_6j）与G2-like家族蛋白相关。GO富集分析显示，所有40个MtLecRLK蛋白均涉及生物过程GO术语：胁迫响应（GO:0006950）、外部刺激响应（GO:0009605）和生物刺激响应（GO:0009607），以及分子功能GO术语：催化活性（GO:0003824）和转移酶活性（GO:0016740）。
3.2.6 MtLecRLK基因的miRNA分析
miRNA调控分析显示，mtr-miR2089-5p和mtr-miR2118与40个MtLecRLK基因中的20个（50%）相互作用，mtr-miR5299与13个基因相互作用，mtr-miR169h和mtr-miR169i与12个基因相互作用。基于盐胁迫基因表达数据（GEO GSE121969数据集），mtr-miR2089-5p、mtr-miR2118、mtr-miR5558-3p和mtr-miR2601在100 mM NaCl处理72小时的蒺藜苜蓿幼苗中表达上调。
3.3 MtLecRLK基因的表达分析
基于NCBI GEO数据库GSE173197数据集的计算机模拟表达分析显示，当蒺藜苜蓿根系经100 mM NaCl处理24小时后，14个基因（MtLecRLK_1b、MtLecRLK_1e、MtLecRLK_1g、MtLecRLK_2b、MtLecRLK_2c、MtLecRLK_3g、MtLecRLK_3h、MtLecRLK_3i、MtLecRLK_4b、MtLecRLK_4d、MtLecRLK_6a、MtLecRLK_6h、MtLecRLK_6j和MtLecRLK_6l）表达上调，占全部MtLecRLK基因的35%。
四、讨论与结论
讨论部分指出，拟南芥LecRK-IX.1和LecRK-IX.2与MtLecRLK_3a形成一组，可能参与疫霉（Phytophthora）抗性（生物胁迫）并响应冷、干旱、UV-B、渗透压、盐度、热、损伤或遗传毒性物质等非生物胁迫。AtLecRK-V.5与MtLecRLK_6a–6l密切相关，可能在丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）诱导时调节气孔免疫。豆科凝集素（可能为Lectin_legB）可抑制变形链球菌（Streptococcus mutans）生物膜形成，并在植物胁迫抗性中发挥多种作用，如调节盐度响应。蛋白激酶/酪氨酸激酶（PK_Tyr_Ser-Thr）的过表达可显著增强干旱、盐和冷胁迫耐受性。与蒺藜苜蓿L型MtLecRLK基因类似，大豆70%的L型LecRLK基因无内含子，且GmLecRLK调控盐响应基因以助于盐胁迫耐受。定位于质膜的AtLecRKA4.1与MtLecRLK_6a–6l形成一组，可能在拟南芥种子萌发过程中参与ABA响应。串联重复基因帮助向日葵耐受非生物胁迫，可能在蒺藜苜蓿中具有类似功能。MYB/MYC、ABRE、WRKY、CBF和DRE/CRT顺式元件是许多转录因子的结合位点，在拟南芥、番茄、水稻等植物的胁迫相关基因调控中发挥重要作用。CPP和G2-like转录因子家族在紫花苜蓿（M. sativa）中响应干旱和盐胁迫，在其他植物中响应热、冷、脱水、涝渍和生物胁迫。干旱和盐胁迫可能增加mtr-miR2089、mtr-miR2118和mtr-miR5558的表达。AtLecRK-V.5与MtLecRLK_6a、6h和6l密切相关，这些基因可能参与气孔免疫，与CPP和G2-like转录因子相关，与胁迫相关顺式元件和GO术语呈中度至高度关联，并与盐处理下过度表达的3至4个miRNA相互作用。
研究结论：研究人员对蒺藜苜蓿L型LecRLK基因家族进行了全基因组研究，利用60个L型GmLecRLK在蒺藜苜蓿基因组中鉴定出40个MtLecRLK基因，并研究了其系统发育关系、理化性质、基因、保守结构域和基因结构、亚细胞和染色体位置、Circos、顺式和反式调控元件、GO注释、miRNA靶标及计算机模拟表达。MtLecRLK_6a、6h和6l可能是蒺藜苜蓿胁迫抗性研究中值得进行湿实验验证的有前景候选基因。这些发现为后续蒺藜苜蓿胁迫信号传导的湿实验研究建立了可靠的L型MtLecRLK候选基因集，从而加速从基因组注释到性状改良的转化流程。
