经颅彩色编码双功能超声评估中度创伤性脑损伤后脑血流与脑微血管结构纵向变化的关系

《Brain Sciences》：Association Between Cerebral Blood Flow and Longitudinal Cerebral Microvascular Structure Changes in Moderate Traumatic Brain Injury Assessed by Transcranial Color-Coded Duplex Ultrasonography

　　

目的：创伤性脑损伤后的微血管损伤是神经功能障碍发生的基础。本研究旨在利用经颅彩色编码双功能超声（TCCD）动态观察脑血管血流动力学，以评估创伤性脑损伤前后微循环网络的稳定性。方法：在本研究中，建立了大鼠中度创伤性脑损伤模型，包括假手术组以及伤后第1天（1 d）、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d和35 d的创伤性脑损伤组（每组n = 5），并对每组进行TCCD和病理学检查。通过检查获取每个亚组的血流动力学参数。重要的是，研究人员从组织学脑切片中量化并归一化伤侧脑组织的血管密度（VDnorm）、末端点数量（NEPnorm）和平均血管直径（AVDnorm），以计算微循环结构评分（MSS），同时通过TCCD获得包括搏动指数（PI）在内的颅内血管血流动力学指标。研究人员分析了微循环参数与血管血流动力学参数之间的相关性，以验证PI是否能反映创伤性脑损伤后的微循环改变。结果：本研究发现，创伤性脑损伤后1–3天是血管损伤的高峰期。从5到14天，微血管密度和颅内大血管血流量参数在微循环结构恢复之前恢复。从21到35天，微血管持续重塑，其中AVDnorm与大脑中动脉皮质支的PI（MCAcb-PI）呈负相关（r = ?0.626，p < 0.001）。随后，研究人员构建了一个加权PI（PIindex），其与微循环损伤评分MSS呈正相关（r = 0.592，p < 0.001）。结论：PIindex可定量评估微循环损伤和血管结构重塑。TCCD作为一种简便可行的新型工具，可用于监测创伤性脑损伤后的微循环变化。

一、研究背景、现存问题与研究意义

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）是全球公共卫生领域亟待解决的重大挑战。在所有TBI病例中，中度TBI患者约占20%，死亡率超过10%，并且长期罹患癫痫或神经退行性疾病的风险显著升高。然而，这一群体受到的关注却相对不足。目前，临床上对TBI的管理主要依赖患者症状、神经认知评估和体格检查，但TBI患者的临床病程高度异质。即使临床症状消退，脑血流的变化仍可能持续存在，而脑血流的不完全恢复可能使患者更易出现严重的神经功能障碍。因此，迫切需要深入探索中度TBI的监测策略。

微血管损伤是TBI重要的神经病理改变之一，与创伤后代谢改变、认知和功能结局以及神经退行性疾病的发生密切相关，具有重要的临床意义。脑血流（cerebral blood flow，CBF）受损是微血管损伤、破坏和重塑的重要生物标志物。血流动力学异常与微循环改变通过紧密耦合的级联事件和相互依赖的调节关系联系在一起，这为实施针对性的TBI精准个体化治疗策略提供了可能。然而，目前对于TBI后微血管损伤的监测手段尚不充分，且很少有研究探讨创伤后不同时间点血流动力学变化与微循环损伤之间的相关性。

传统经颅多普勒超声（transcranial Doppler，TCD）虽可用于评估颅内血管血流动力学，但其无法定位脑组织解剖结构，难以精确锚定创伤病灶周围的微血管损伤区域。而CT灌注成像和磁共振灌注成像则存在辐射暴露、造影剂肾病风险、无法实时动态床旁重复检测以及检查费用高等缺点，不适合对中度至重度TBI患者进行病程的连续监测。经颅彩色编码双功能超声（transcranial color-coded duplex ultrasonography，TCCD）将二维灰阶实时成像与彩色编码双功能超声成像相结合，能够识别与关键解剖血管标志相关的颅内血管，并在感兴趣区域内进行多点采样，综合评价受试者的血流动力学变化。基于此，该临床前研究建立大鼠TBI模型，利用TCCD阐明TBI后脑供血动脉脑血流的动态变化，并进一步探讨血流动力学变化与受伤脑区微血管结构改变之间的相关性，为通过靶向脑血流调节改善TBI患者预后提供实验证据。

二、主要关键技术方法

1. 1.
   动物模型建立：选用成年雄性Sprague-Dawley大鼠，采用改良的自由落体撞击法建立标准化中度TBI大鼠模型。以bregma为原点，确定撞击点为矢状缝右侧2 mm、冠状缝后1 mm，在此中心点制作直径5 mm的圆形颅窗，保持硬脑膜完整。将20 g重物从30 cm高度落下，撞击置于颅窗上方的铆钉，撞击深度约1 mm。假手术组仅行开颅暴露硬脑膜，不施加撞击。除假手术组外，TBI大鼠被随机均分为伤后1天、3天、5天、7天、10天、14天、21天和35天共8个组。
2. 2.
   TCCD数据采集：使用ULTIMUS 9E超声系统，配置23 MHz经颅探头，通过支撑臂固定在大鼠颅窗上方获取脑血流动力学数据。由一名拥有10年专业经验的美国诊断医学超声注册处认证超声医师，通过冠状面连续监测5个心动周期的主要皮质供血动脉，记录颈内动脉终末段、颈内动脉终末段、大脑中动脉、大脑中动脉皮质支和后循环动脉的收缩期峰值流速、舒张期末流速和搏动指数。
3. 3.
   组织固定与病理染色：TCCD检查后，大鼠经心脏灌注冷生理盐水，取脑组织进行后续处理。脑组织切片与CD31抗体孵育过夜，随后与二抗孵育，并用DAPI染色。所有病理切片使用3D全景扫描仪进行全景扫描，并使用Case Viewer软件进行图像处理。
4. 4.
   微循环分析与评分：在损伤部位周围随机选取三个区域进行参数分析，使用AngioTool 2.0版软件对感兴趣区域进行定量分析，包括血管密度、末端点数量和平均血管直径。为消除量纲差异，对上述三个形态学参数进行Min-Max归一化处理，并进行方向性转换，最终通过求和得到微循环结构评分，分值范围0至3分，分数越高表示微循环结构整体破坏越严重。

三、研究结果

3.1 TBI大鼠模型概况：共使用55只大鼠，45只存活。10只大鼠在实验中死亡，死亡率为18.2%。最终，假手术组分配5只大鼠，40只TBI大鼠随机分配到各时间点组。术前探查颈总动脉颈段血流速度，各组间动脉血流速度无差异。

3.2 微循环的时间变化：TBI后，HE染色显示部分皮层脑组织缺损和血管周围间隙扩大。通过CD31荧光染色发现，不同时间点的血管密度、末端点数量和平均血管直径均发生显著变化。

3.2.1 血管密度：假手术组VD_norm为0.29 ± 0.08。与假手术组相比，伤后3天血管密度显著下降至0.11 ± 0.06，但于5天恢复，至14天密度增加并维持至研究结束。

3.2.2 末端点数量：假手术组NEP_norm为0.39 ± 0.08。伤后3天观察到NEP_norm显著减少至0.24 ± 0.03，随后从5天到10天逐渐恢复至基线水平。值得注意的是，NEP_norm在14天急剧增加并达到峰值，然后在21天和35天逐渐下降并恢复到假手术组水平。

3.2.3 平均血管直径：假手术组AVD_norm为0.61 ± 0.05。伤后1天观察到显著的血管扩张，AVD_norm增至0.77 ± 0.07。至3天和5天，血管直径明显变窄，AVD_norm显著降低。血管直径在7天完全恢复到基线水平，并在随后的实验期间保持稳定。

3.2.4 微循环结构评分：假手术组MSS为1.71 ± 0.15。伤后3天微循环形态损伤显著加重，MSS显著升高至2.37 ± 0.20。随后MSS随时间逐渐下降，在14天和21天显示出比假手术组显著更低的评分。

3.3 TBI后的血流动力学变化：使用TCCD监测各组大鼠颅内血管的血流动力学参数，结果显示PSV、EDV和PI随时间呈现波动性变化。PSV方面，大脑中动脉皮质支PSV在伤后1天和3天显著升高；大脑中动脉PSV在伤后10天短暂升高；后循环动脉PSV在伤后3天升高。EDV方面，大脑中动脉皮质支EDV在伤后1天显著升高。PI方面，颈内动脉PI在伤后1天和3天显著升高；大脑中动脉PI在伤后1天显著升高；后循环动脉PI在伤后3天升高；大脑中动脉皮质支PI在伤后1天短暂降低，3天显著升高。所有血管的PI从伤后5天至7天逐渐下降，从10天至35天基本恢复至基线水平。

3.4 微血管形态与血流动力学参数的相关性：相关性分析显示，颈内动脉PI与NEP_norm呈负相关；大脑中动脉皮质支PI与微血管管腔直径AVD_norm呈负相关；微循环结构评分MSS与大脑中动脉皮质支PI呈正相关。进一步分析发现，大脑中动脉皮质支PI与大脑中动脉PI和后循环动脉PI均呈正相关。为整合大脑中动脉和后循环对大脑中动脉皮质支PI的影响，研究人员提出了PI_index，其定义为基于大脑中动脉和后循环供血比例加权的PI。PI_index与MSS的相关性增强。在控制时间因素后进行偏相关分析，结果显示PI_index与MSS之间存在显著的正偏相关。Bland-Altman分析显示大多数观测点分布在95%一致性范围内。

四、讨论总结与结论翻译

讨论总结：稳定的脑血流是维持正常神经功能的先决条件。该研究首次在多时间点定量分析TBI后损伤区域的脑血管形态，同时利用TCCD序贯监测颈内动脉、大脑中动脉、后循环动脉和皮质血管。研究发现，损伤后微血管结构与颅内血管血流量参数的时序演变模式不同，持续的微血管修复是脑灌注长期稳定恢复的必要前提。血管损伤高峰期为伤后1至3天。伤后1天，微血管形态未见明显结构性损伤，但出现代偿性扩张；血流动力学上表现为早期外周脑血管阻力调节紊乱。伤后3天，微血管结构损伤和血流动力学紊乱达到高峰。伤后5至7天进入早期修复期，微血管密度开始恢复，分支结构逐渐修复。伤后10天，微血管结构进一步修复。伤后14天，代偿性微血管重塑达到高峰，微循环MSS评分降低。伤后21至35天，各级颅内血管的血流动力学参数均无显著差异，但微血管重塑仍在进行。总之，TBI后血管损伤与修复表现出显著的时间特征，大血管血流量功能的恢复与微血管结构重塑之间存在时间上的分离，大血管血流动力学参数并不能指示微循环结构损伤的完全修复。

结论翻译：微循环损伤是TBI重要的病理生理过程，脑血管结构损伤和血管功能障碍参与了TBI的发展和修复过程。TCCD能够实现创伤后脑血的精确定位和动态监测。结合PI_index评估微循环损伤，为临床早期脑血流干预提供了一种简便可行的新方法和定量依据。