《Applied and Environmental Microbiology》：Lineage II Escherichia coli O157:H7: genomes, prophages, colicins, and the absence of detectable Stx2
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对三株具有不同脉冲场凝胶电泳（PFGE）图谱的Ⅱ系（lineage II）大肠杆菌（E. coli）O157:H7菌株（FRIK2069、FRIK2455和FRIK2533）进行了基因组测序、组装和比较分析。研究结果显示，这些基因组高度相关且整体保持共线性（s
对三株具有不同脉冲场凝胶电泳（PFGE）图谱的Ⅱ系（lineage II）大肠杆菌（E. coli）O157:H7菌株（FRIK2069、FRIK2455和FRIK2533）进行了基因组测序、组装和比较分析。研究结果显示，这些基因组高度相关且整体保持共线性（synteny），唯FRIK2069菌株存在一个302 kbp的染色体倒位（inversion）。FRIK2533菌株缺失pO157质粒，这可能解释其有限的分离频率。FRIK2455是多年分离中的优势菌株，研究人员将其与Ⅰ系（lineage I，Sakai菌株）及Ⅰ/Ⅱ系（lineage I/II，EC4115菌株）代表菌株进行比较。三个系别在前噬菌体（prophage）和移动遗传元件（MGEs）中均鉴定出显著的多态性。所有系别均携带stx1前噬菌体和肠细胞脱落位点（locus of enterocyte effacement，LEE）。stx2a前噬菌体存在于Sakai和EC4115菌株中，而stx2c前噬菌体则见于EC4115和FRIK2455菌株。研究人员对来自美国11株地理上分散的Ⅱ系菌株进行了功能性噬菌体和Stx2检测。其中3株Ⅱ系菌株在丝裂霉素C（MMC）处理后24小时出现延迟裂解。在3株裂解菌株中，有2株检测到stx2转录，但通过Western blot在所有裂解或非裂解的Ⅱ系菌株中均未检测到Stx2蛋白。来自8株Ⅱ系菌株的裂解液上清因产生大肠菌素（colicin，D、B或M型）而抑制了噬菌体宿主菌（E. coli MG1655菌株）的生长。这些发现进一步证实了Ⅱ系肠出血性大肠杆菌（EHEC）不产生功能性噬菌体或可检测水平Stx2的证据。此外，大肠菌素的产生和pO157质粒可能是EHEC菌株在牛宿主及农场环境中持续存在的关键特征。
论文解读文章
一、研究背景与意义
肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E. coli，EHEC）O157:H7是引起食源性疾病的重要病原体，也是产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing E. coli，STEC）中最主要的成员。牛是EHEC的主要储存宿主，尽管EHEC仅是牛肠道微生物群中的次要且短暂的共生菌。人类感染通常源于摄入受污染的食物或水，症状包括腹部绞痛、出血性结肠炎，部分病例可发展为溶血性尿毒综合征（hemolytic uremic syndrome，HUS），这是一种可能引发肾衰竭的致命性疾病。既往EHEC感染还与感染后8年内高血压、肾功能损害和心血管疾病风险增加相关。
EHEC基因组富含移动遗传元件（mobile genetic elements，MGEs），包括前噬菌体（prophage）、前噬菌体样元件（prophage-like elements，PLEs）、插入序列（insertion sequences，ISs）和质粒，但基因组整体呈单态性。EHEC中的前噬菌体大多为隐蔽性的，无法完成裂解生命周期，但部分stx2前噬菌体除外。通过基于八聚体的基因组扫描（octamer-based genome scanning，OBGS）技术，研究人员将牛源和临床分离株划分为Ⅰ系（lineage I，LI）和Ⅱ系（lineage II，LII）两个谱系。随后开发的系别特异性多态性分析（lineage-specific polymorphism assay，LSPA-6）以及基于微阵列的比较基因组杂交和in silico分析又鉴定出第三个系别——Ⅰ/Ⅱ系（lineage I/II）。LI和LI/II菌株在临床来源分离中具有非随机偏向性，而LII菌株仅从牛及农场环境中分离，从未在临床样本中出现，提示LII菌株对人类可能具有降低或有限的毒力。
此前一项研究对威斯康星州两个奶牛场8年间收集的EHEC菌株进行了基因组变化特征分析，发现LII菌株在R农场呈地方性流行，且该农场分离的LII菌株不产生可检测水平的Stx2。然而，关于LII菌株基因组序列和功能特征的数据仍然匮乏。本研究旨在通过测序和比较三株来自同一农场的LII菌株基因组，并评估来自美国不同地理区域的LII分离株的Stx2产生能力、功能性噬菌体产生情况及大肠菌素产生特征，以加深对LII菌株生态学、进化及毒力潜力的理解。
二、研究内容与主要结论
研究人员对来自威斯康星州一个奶牛场的三株具有不同脉冲场凝胶电泳（PFGE）图谱的LII菌株（FRIK2069、FRIK2455和FRIK2533）进行了PacBio单分子实时（SMRT）测序和基因组组装。比较基因组分析显示，三株菌的染色体高度相关且整体共线性，唯FRIK2069存在一个302 kbp的染色体倒位，该倒位两端由两个前噬菌体（Φ2455-9和Φ2455-10）中的2,485 bp反向重复序列界定，提示同源重组是导致该倒位的原因。FRIK2455是该农场多年采样中的优势菌株。质粒含量方面，FRIK2455和FRIK2069均携带pO157、p35K和pColD157三个质粒，而FRIK2533缺失pO157但携带p35K和pColD157。pO157的缺失可能解释了FRIK2533仅从单一水样中分离的现象。
在跨系别比较中，研究人员将FRIK2455（LII代表株）与Sakai（LI代表株）和EC4115（LI/II代表株）的基因组进行了比对。三株菌染色体共有5,122 kbp保守区域，Sakai、EC4115和FRIK2455分别含有219 kbp、303 kbp和487 kbp的独有序列。差异主要集中在MGEs区域。所有三个系别均含有整合在mlrA位点的前噬菌体，其中Sp15和Φ2455_16携带stx1，而ΦEC4115_17缺乏stx1。stx2a前噬菌体存在于Sakai（整合于wrbA位点）和EC4115（整合于argW位点），而FRIK2455缺乏stx2a。stx2c前噬菌体（ΦEC4115_14和Φ2455_14）存在于EC4115和FRIK2455中，整合于sbcB位点，但在Sakai中缺失。此外，Mu样前噬菌体在Sakai和FRIK2455中整合于不同位点（sorM和yhcL），而在EC4115中缺失。三个系别均含有LEE致病岛（位于SpLE4/PLE_EC4115_4/PLE_2455_6中，相似度99.9%）。
在功能验证方面，研究人员对11株LII菌株及LI（EDL933）和LI/II（FRIK1919）对照菌株进行了丝裂霉素C（MMC）诱导裂解和功能性噬菌体产生检测。LI和LI/II对照菌株在MMC处理后4小时即发生裂解并产生噬菌斑。11株LII菌株中，仅3株（1081-9-1、0768-2-1和1077-4-1）在24小时后发生延迟裂解，但所有LII菌株均未产生可检测的噬菌斑。值得注意的是，8株LII菌株的上清液对指示菌株E. coli MG1655具有杀菌活性。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合软琼脂覆盖法和nanoLC-MS/MS分析，研究人员鉴定出该杀菌化合物为大肠菌素D（colicin D），其编码基因位于pColD157质粒上。7株产生杀菌活性的菌株携带pColD157，而菌株1081-9-1虽不携带pColD157，但其含有一个20.9 kb的新型质粒p20K，该质粒携带编码大肠菌素B和M的基因。在stx2表达检测中，RT-PCR结果显示2株裂解性LII菌株（1081-9-1和1077-4-1）和1株非裂解性菌株（0396-2-2）检测到stx2转录，但Western blot在所有LII菌株中均未检测到Stx2蛋白，而LI和LI/II对照菌株均为阳性。
三、主要技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：PacBio RS II平台单分子实时（SMRT）测序结合HGAP3和FALCON软件进行de novo组装获得完整基因组；利用ProgressiveMauve和BLAST进行多基因组比对和共线性分析；基于VICTOR工具对57个前噬菌体进行聚类分析；采用质粒SPAdes（plasmidSPAdes）组件进行质粒鉴定；通过丝裂霉素C诱导实验评估前噬菌体裂解能力；利用噬菌斑实验检测功能性噬菌体产生；通过非变性PAGE结合软琼脂覆盖法和nanoLC-MS/MS鉴定杀菌化合物；采用RT-PCR检测stx2转录水平；通过Western blot检测Stx2蛋白表达。菌株来源包括威斯康星州奶牛场分离的3株LII菌株（FRIK2069、FRIK2455和FRIK2533）以及来自美国7个州的8株LII牛源分离株（国家奶牛小母牛评估项目），另有Sakai（LI）、EDL933（LI）、EC4115（LI/II）和FRIK1919（LI/II）作为参考菌株。
四、研究结果
菌株信息：研究共纳入15株EHEC菌株。三株LII菌株（FRIK2069、FRIK2455和FRIK2533）来自同一威斯康星州奶牛场但具有不同的PFGE图谱，FRIK2455为多年分离中的优势基因型。8株额外的LII菌株来自美国7个州的奶牛犊牛。
MMC诱导裂解与Stx2噬菌体产生：LI（EDL933）和LI/II（FRIK1919）菌株在MMC处理后4小时发生裂解并产生功能性噬菌斑。11株LII菌株中仅3株（1081-9-1、0768-2-1和1077-4-1）在24小时后发生延迟裂解，但均未产生可检测的噬菌斑。
杀菌化合物：8株LII菌株产生对MG1655具有杀菌作用的蛋白类化合物。菌株0767-8-1的裂解液完全抑制MG1655生长，其余7株产生部分抑制。
杀菌化合物的鉴定：通过非变性PAGE结合nanoLC-MS/MS分析，鉴定出该杀菌化合物为大肠菌素D及其相关免疫蛋白。
质粒与大肠菌素产生：7株产生杀菌活性的菌株携带pColD157质粒。菌株1081-9-1不携带pColD157但含有携带大肠菌素B和M基因的p20K质粒。菌株0459-3-1虽携带pColD157但不产生杀菌化合物。pO157存在于所有有基因组数据的菌株中，唯FRIK2533缺失。
stx2转录与Stx2检测：RT-PCR在2株裂解性LII菌株（1081-9-1和1077-4-1）和1株非裂解性菌株（0396-2-2）中检测到stx2转录，但Western blot在所有LII菌株中均未检测到Stx2蛋白。
LII菌株测序：三株LII菌株染色体大小为5,645,219至5,645,233 bp，G+C含量均为50.5%，rRNA和tRNA数量相同。FRIK2069具有最多的编码序列（5,268个）。
LII菌株基因组比较：三株菌染色体高度相关且共线性，唯FRIK2069存在302 kbp倒位。质粒含量差异是主要区别，FRIK2533缺失pO157。
三个EHEC系别的基因组比较：Sakai（LI）、EC4115（LI/II）和FRIK2455（LII）基因组间差异主要集中在MGEs区域。stx2a前噬菌体在Sakai整合于wrbA位点、在EC4115整合于argW位点，而FRIK2455缺失stx2a。stx2c前噬菌体存在于EC4115和FRIK2455但缺失于Sakai。所有菌株均含有stx1和LEE。
EHEC系别内的前噬菌体和PLE：Sakai含有18个前噬菌体和6个PLE，EC4115含有20个前噬菌体和6个PLE，FRIK2455含有19个前噬菌体和8个PLE。57个前噬菌体被分为22个组，20个PLE被分为9个组。
前噬菌体组的特征：mlrA整合组中，携带stx1的Sp15和Φ2455_16与缺乏stx1的ΦEC4115_17相似度较低（58.1%）。sbcB整合的stx2c前噬菌体（ΦEC4115_14和Φ2455_14）中度保守（91.5%）。wrbA/argW整合的stx2a前噬菌体（Sp5和ΦEC4115_18）保守性降低（83.3%）。
前噬菌体聚类分析：VICTOR聚类分析与最优比对结果一致，唯ΦEC4115_9和Φ2455_9分别与ΦEC4115_16和Sp10聚为一类。
PLE整合位点：FRIK2455含有8个PLE，其中PLE_2455_1（85.30 kbp）和PLE_2455_5（10.88 kbp）为FRIK2455独有。含LEE的PLE组（SpLE4、PLE_EC4115_4和PLE_2455_6）相似度达99.9%。
插入序列分布：Sakai和EC4115各含17个完整IS629元件，FRIK2455含15个。IS629常整合于前噬菌体或PLE中。FRIK2455含11个ISEc8元件，多于Sakai和EC4115各8个。
五、讨论与结论
本研究表明，LII菌株的染色体异质性主要与MGEs相关，特别是前噬菌体和PLEs。三个系别在stx基因型及前噬菌体整合位点上存在特征性差异：stx1前噬菌体存在于所有系别（整合于mlrA位点），stx2a前噬菌体存在于LI（wrbA位点）和LI/II（argW位点）但缺失于LII，stx2c前噬菌体存在于LI/II和LII（sbcB位点）但缺失于LI。功能验证证实LII菌株不产生功能性噬菌体或可检测水平的Stx2，尽管部分菌株存在stx2转录。LII菌株普遍产生大肠菌素（9/11株），其中以大肠菌素D为主（由pColD157质粒编码），部分菌株通过p20K质粒产生大肠菌素B和M。pO157质粒和/或染色体倒位可能对EHEC在牛及农场环境中的持续存在起重要作用。LII菌株缺乏功能性噬菌体和可检测Stx2的事实可能解释了为何LII菌株从未在人类临床样本中分离。未来研究应关注大肠菌素和pO157在EHEC于牛及农场环境中持续存在中的作用。
