从河流源头到废水排放口：42 °C培养联合物种水平鉴定揭示碳青霉烯耐药细菌（CRB）的双重分布模式

《Processes》：Presence of Carbapenem-Resistant Bacteria Across a River Pollution Gradient

　　

碳青霉烯耐药细菌（CRB）在受废水影响的河流中被越来越多地记录，但其在整个河流连续体中的分布仍知之甚少。研究人员分析了河流生态系统中CRB的分布，从参照河流源头到受医院和城市废水严重影响的地点。对在42、35和22 °C培养的CRB种群（CR₄₂；CR₃₅；CR₂₂）以及异养细菌（heterotrophic bacteria）和肠道肠球菌（intestinal enterococci）进行了定量。CR₃₅和CR₂₂组分在整个河流连续体中均被检出，包括河流源头，提示推测为环境来源的CRB可能在这些河流中形成广泛种群。CR₄₂组分在河流源头未检出，且在低人为影响地点浓度显著低于受废水影响地点。具有公共卫生重要性的CRB物种，如鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）和布甘肠杆菌（Enterobacter bugandensis），主要在42 °C分离，且仅从医院和污水处理厂排放下游地点回收。总体而言，公共卫生关注的CRB与医院和城市废水输入相关，而推测为环境来源的CRB代表整个河流流动中广泛存在的背景种群。42 °C培养结合物种水平鉴定，为区分废水相关组分与环境背景提供了潜在方法。

论文解读：CRB在临床和环境设置中日益被检出，已被发现于医院和城市废水、污水处理厂（WWTP）、自然水体、土壤、植物和动物等多种环境来源。该群体中，引起难治性医院感染、常被称为对最后 resort 抗生素耐药的CRB尤受关注；世界卫生组织已将碳青霉烯耐药Acinetobacter baumannii、Enterobacterales和Pseudomonas aeruginosa列为具有公共卫生重要性的优先病原。然而碳青霉烯耐药并不限于这些优先细菌，许多环境物种具有对碳青霉烯的固有耐药并自然存在于水体和陆地生态系统。公共卫生重要的革兰阴性CRB如Klebsiella pneumoniae、P. aeruginosa和A. baumannii常在河水中被报道，提示其可能超出医院环境传播，并归因于未经处理或处理不当的医院和城市废水排放。尽管废水排放影响已被认识，但考察从原始河源到下游受废水影响区域整个河流梯度的CRB分布研究仍有限；既往研究多聚焦单一污染点或重影响地点，对河源和低人为影响地点以及环境CRB研究不足。另一个限制是缺乏区分水样中优先CRB与推定环境CRB的标准方法；环境CRB（如Stenotrophomonas sp.、Aeromonas sp.）常过生长，且对碳青霉烯固有耐药但公共卫生风险有限。42 °C培养可减少推定环境CRB生长、改善优先CRB回收，但并非完全选择，因为部分环境CRB也可耐受该温度。因此，需要在全河流连续体比较不同人为输入下公共卫生重要CRB与环境CRB的分布，并探索培养温度结合物种鉴定的区分价值。研究人员以克罗地亚大陆区的Krapina河和Sava河为模型系统，从参照河源到受不同人为输入影响的下游区域开展研究，采集水和沉积物，分析CRB、作为粪便污染指示的肠道肠球菌（IE）和作为有机负荷指示的异养细菌（HB），描述农村地区、农业和居民区废水、医院和城市废水以及二级WWTP出水对优先CRB和环境CRB发生的影响。研究得出结论：CR₃₅和CR₂₂在全河流连续体广泛检出，推测环境CRB构成广泛背景种群；CR₄₂缺失于参照河源并与人为影响相关；公共卫生重要CRB主要在42 °C回收，且主要与医院和城市废水及WWTP排放下游相关。其重要意义在于提示42 °C培养联合物种水平鉴定可作为区分废水相关CRB与环境背景的潜在方法，并说明沿全河流连续体监测可提供仅关注废水影响点可能遗漏的信息。

关键技术方法（不超过250字）：样本队列来源为克罗地亚大陆区Krapina河与Sava河，2024年10月至2026年2月采样，秋冬各两次、春夏各一次，覆盖河源、支流源、农村非点源、医院和城市废水及WWTP下游。研究人员采集水与表层沉积物，按22、35和42 °C培养定量CR₂₂、CR₃₅和CR₄₂，并测定HB与IE；对分离株采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定，按EUCAST纸片扩散法进行碳青霉烯药敏试验，对优先CRB用免疫层析检测碳青霉烯酶；统计分析采用Kruskal–Wallis、Spearman相关和重复测量ANOVA。

研究结果：3.1 生态参数分析（Ecological Parameters Analysis）：通过监测期水温、pH、水位和流量测定，发现水温呈季节性变化，冬季最低、春夏季最高；支流源B受热泉影响冬季水温显著较高；各点pH总体中性，冬季和春季略偏碱；两河水位和流量均在多雨冬季达峰、干旱夏季最低，Sava河因流域面积和河流规模较大而保持较高值。3.2 水与沉积物细菌学分析（Bacteriological Analysis of Water and Sediment）：通过水样和沉积物中HB、IE及三温度CRB定量，发现Krapina河下游4、5、6号点水样中各细菌参数无显著差异，Sava河7、8、9号点除IE在7号点始终低于8和9号点外亦无显著差异；HB在参照河源与Krapina下游无差异而支流源显著较低；IE在支流源A与下游无显著差异，参照河源和支流源B较低；CR₃₅和CR₂₂在所有点检出且支流源较低，提示广泛分布且不依赖点源或非点源废水输入；CR₄₂在水样中于参照河源和支流源B所有季节均缺失，低人为影响点浓度显著低于Krapina下游。沉积物中Krapina下游4、5、6号点除CR₃₅和CR₂₂在5号点始终高于6号点外无显著差异；HB在参照河源和支流源A低于5号点，支流源B低于所有点；IE仅支流源B与5号点差异显著；CR₃₅和CR₂₂在所有点持续存在，CR₃₅在参照点和支流源低于某些下游点，CR₂₂类似但参照河源无显著差异；CR₄₂仅在参照河源缺失，支流源虽检出但低于4和5号点。3.3 季节变化及细菌学与生态参数关系（Seasonal Variations and Relationships Between Bacteriological and Ecological Parameters）：通过相关和季节分析，发现Krapina河水样中各细菌参数彼此正相关，水位和流量与所有细菌参数正相关且与CR₄₂相关性最强，温度与IE负相关、与CR₃₅正相关，pH仅与HB弱正相关；Sava河水样中各细菌参数彼此正相关，水位和流量与HB、IE、CR₄₂、CR₂₂正相关而与CR₃₅无关，温度与CR₃₅正相关、与CR₂₂负相关，pH与HB和IE正相关。Krapina河沉积物中各细菌参数彼此正相关，CR₃₅与CR₂₂相关性最强，水位和流量与所有细菌参数正相关且与CR₄₂和CR₃₅最强；Sava河沉积物中多数细菌参数正相关，CR₃₅与CR₂₂最强，水位和流量与CR₄₂负相关，流量与HB和CR₂₂正相关。季节比较显示Krapina河水仅CR₃₅冬季低于夏季；Sava河水HB冬季最高、CR₂₂冬季较高；Krapina河沉积物IE冬季高于秋季和春季、CR₄₂秋季高于冬季和春季；Sava河沉积物无季节模式。由此提示季节并非这些河流CRB分布的主要控制因素，局地人为输入和水文条件更相关，水和沉积物响应不同。3.4 CRB分离株分布（Distribution of CRB Isolates）：通过分离株MALDI-TOF MS鉴定、药敏和碳青霉烯酶检测，共回收173株，其中132株log(score)足以鉴定到属（30株）或种（102株）；公共卫生重要种主要于42 °C分离，22 °C未回收；A. baumannii和K. pneumoniae最常分离，42 °C分别14和11株，主要见于受医院废水和WWTP出水影响地点，另在8号点发现1株K. pneumoniae；推定环境CRB分布更广，Pseudomonas putida和Pseudomonas sp.最常见并见于所有点，Janthinobacterium lividum广泛分布但仅于22 °C分离，Pseudomonas otitidis、Cupriavidus gilardii和Cupriavidus respiraculi也可在42 °C回收，其他环境CRB主要于35 °C回收且空间分布较局限。所有潜在优先分离株均至少对一种受试碳青霉烯耐药；A. baumannii均检出OXA-23或OXA-40/58，K. pneumoniae以OXA-48为主，NDM和KPC亦在K. pneumoniae、E. bugandensis和E. cloacae中检出。结论为公共卫生关注CRB与医院和城市废水及WWTP下游输入相关，42 °C培养结合物种鉴定有助于区分该组分与环境背景。

讨论部分总结：该研究以河流连续体方法比较低人为影响河源、农村影响点和受城市及医院废水影响区域，结果提示推定环境CRB与公共卫生重要CRB具有不同分布模式。HB和IE部分反映有机负荷和人为影响差异，但IE并非废水输入特异，河源也可受粪便输入影响；CR₃₅和CR₂₂全河检出，说明推定环境CRB可构成河流CRB的重要部分，单独存在不足以证明废水污染；CR₄₂与人为影响密切，参照河源水体和沉积物均缺失，农村支流源缺失或显著较低，且参照河源存在IE而CR₄₂缺失，说明粪便指示与CRB发生并不必然对应。水和沉积物提供互补信息，沉积物可能反映CRB累积并作为潜在储库，细菌吸附于沉积物颗粒和生物膜形成可能保护CRB。总细菌丰度在单个废水输入后并不总明显变化，物种组成可更清晰反映从农村污染到医院和城市废水输入的转变。CRB分布与微生物和水文特征相关，CRB、HB和IE正相关提示共享环境过程；Krapina河水位和流量与所有细菌参数正相关且CR₄₂关系较强，可能反映流量增加时下游传输增强；Sava河关系较不一致，其较大流量可能带来稀释和传输差异；温度和pH关系较弱且不一致。季节差异仅见于少数参数且两河、水体和沉积物模式不一，季节不似主要控制因素，空间人为输入和水文条件更重要。分离株结果显示优先CRB主要在42 °C回收，且多位于医院和城市废水及WWTP出水下游；WWTP虽降低微生物负荷但不消除病原，提示需附加消毒或膜过滤等过程。42 °C并非完全选择，部分推定环境CRB也可生长，因此物种鉴定提供额外信息；表型碳青霉烯耐药及临床重要碳青霉烯酶检出支持该培养方法回收优先CRB的能力。研究聚焦表型耐药，未进行全基因组测序或宏基因组等分子表征，未来可连接河流与医院分离株并研究传播途径。总体提示两种分布模式：环境CRB形成从河源到重影响下游的广泛背景，公共卫生重要CRB主要与医院和城市废水相关；未来废水相关CRB研究应优先采用42 °C培养，IE和HB仅作为粪便污染和有机负荷的一般指标而非废水特异参数。

研究结论翻译：沿整个河流连续体提示CRB可能存在两种分布模式。CR₃₅和CR₂₂在整个河流系统中检出，而CR₄₂在参照地点未检出，并在受人为输入影响的地点更常出现。公共卫生关注的CRB在42 °C回收，且主要与医院和城市废水相关，显示升高培养温度对检测该CRB组分的价值。物种水平鉴定提供了CRB在不同废水输入影响地点分布的额外信息，水文条件和潜在沉积物累积进一步塑造其分布。本研究聚焦表型水平的碳青霉烯耐药，未进行耐药基因的分子表征，应纳入未来研究。尽管如此，这些发现表明培养温度结合物种水平鉴定可为区分公共卫生重要CRB与主要环境CRB以及解释其在环境中的分布提供可靠信息。