产后放牧奶牛宫颈中性粒细胞浸润的繁殖阶段依赖性及其与宏观宫颈外观、细胞学子宫内膜炎的关系

《Animals》：Cervical Neutrophil Infiltration in Relation to Macroscopic Cervix Appearance, Cytological Endometritis, and Reproductive Stage in Postpartum Grazing Dairy Cows

　　

摘要：牛宫颈发生内分泌依赖性生理变化，可能影响局部免疫活性并使宫颈炎症的解释复杂化。研究人员评估了产后放牧奶牛宏观宫颈外观、宫颈中性粒细胞浸润、繁殖阶段和子宫内膜炎症之间的关系。80头泌乳天数（days in milk, DIM）≥45 d的非妊娠泌乳荷斯坦×娟姗杂交奶牛接受了繁殖检查、宫颈视频内镜、超声检查、宫颈和子宫内膜细胞学及血清孕酮测定。宏观宫颈外观分为C0、C1或C2，而宫颈多形核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophil, PMN）百分比作为主要比例结局采用调整分数logistic回归（fractional logistic regression）分析。二次分析中操作性采用宫颈PMN≥5%阈值。C0、C1和C2分别占30.0%、50.0%和20.0%，20.0%奶牛宫颈PMN≥5%。宏观宫颈外观与宫颈PMN百分比（p = 0.931）或宫颈PMN≥5%（p = 1.000）无关。卵泡期奶牛宫颈PMN百分比高于黄体期（p < 0.001）。采用分数logistic回归调整胎次和细胞学子宫内膜炎（cytological endometritis）后，该关联持续存在（回归系数β = 2.42；95%置信区间（confidence interval, CI），0.81–4.03；p = 0.003），调整边际差异为10.48个百分点（95% CI，1.42–19.54；p = 0.023）。补充的两部分分析支持该关联，显示卵泡期可检测到宫颈PMN的比值比（odds ratio, OR）更高（OR = 4.71；95% CI，1.73–12.82；p = 0.002），且阳性观察中平均PMN比例更高（平均比 = 4.11；95% CI，1.40–12.06；p = 0.010）。在二次Firth惩罚logistic回归（Firth penalized logistic regression）中，卵泡期仍与宫颈PMN≥5%相关（调整比值比（adjusted odds ratio, aOR）= 5.38；95% CI，1.39–20.83；p = 0.015）。宫颈与子宫内膜PMN百分比呈弱正相关（Spearman秩相关系数ρ = 0.240；p = 0.033），而宫颈PMN≥5%与细胞学子宫内膜炎的一致性有限（Cohen κ = 0.258）。宫颈中性粒细胞浸润和细胞学子宫内膜炎均与后续妊娠无关，而血清孕酮浓度与妊娠呈探索性正相关。宫颈中性粒细胞浸润与繁殖阶段相关，且独立于胎次和细胞学子宫内膜炎，不依赖未经验证的诊断阈值。因此，宫颈细胞学应在奶牛的繁殖和生理背景下解释。

研究背景：奶牛产奶量提高伴随营养和代谢需求增加，使产后子宫疾病易发，并损害卵巢功能、受孕率和整体繁殖效率。尽管子宫疾病认识不断深入，产后生殖道炎症诊断仍困难，因为炎症与生理变化常在常规产后检查中并存。宫颈作为阴道与子宫之间的解剖和功能屏障，除机械屏障外还可能参与局部免疫调节，但在产后繁殖检查中关注相对有限。已有研究报道产后奶牛临床宫颈炎和宫颈细胞学中性粒细胞比例升高，但宏观宫颈外观与宫颈中性粒细胞浸润是否代表同一生物学过程尚不清楚；同时，宫颈受卵巢类固醇激素调节，卵泡期和黄体期在宫颈松弛度、血管灌注、黏液和免疫活性方面不同，可能混淆宫颈炎症解释。宫颈与子宫内膜炎症可共存但未必等同，高海拔放牧系统相关资料尤其缺乏。因此，研究人员在产后放牧奶牛中表征宏观宫颈外观和宫颈PMN浸润，评估其与繁殖阶段的关系，并分析宫颈PMN浸润与细胞学子宫内膜炎的关系及两种细胞学分类的一致性。研究结论强调繁殖阶段对宫颈细胞学解释的重要性，并支持将PMN浸润作为连续指标而非仅依赖未验证的宫颈炎诊断阈值。

关键技术方法：样本来自哥伦比亚Nari?o地区Pasto亚区AGROSAVIA Obonuco研究中心高海拔放牧奶牛群，纳入80头≥45 DIM非妊娠泌乳Holstein × Jersey杂交牛。采用横断面观察设计，在同一繁殖检查中行阴道镜和视频内镜评估宫颈宏观外观（C0–C2）、Cytobrush采集宫颈与子宫内膜细胞学、经直肠触诊和超声评估卵巢结构及繁殖阶段，并以竞争性酶免疫分析（enzyme immunoassay）测定血清孕酮。宫颈PMN百分比为主要比例结局，采用调整分数logistic回归，辅以两部分模型和Firth惩罚logistic回归，并以≥3%、≥5%、≥10% PMN阈值作敏感性分析；细胞学采用盲法双读评估观察者内和观察者间一致性。

研究结果：
3.1 研究群体：115头产后奶牛筛选，35头因难产、胎衣不下、全身疾病、脓性阴道分泌物（purulent vaginal discharge, PVD）及不符合C0–C2分类的宏观宫颈病变等排除，80头纳入；包括29头初产、22头2–4胎、19头5–6胎和10头≥7胎，检查时平均产奶量16 L/cow/day；卵泡期和黄体期血清孕酮中位数分别为5.75 ng/mL和7.19 ng/mL，差异无统计学意义（Mann–Whitney U检验，p = 0.151），黄体期数值较高与黄体期孕酮分泌的预期生理模式一致。

3.2 宏观宫颈外观与宫颈中性粒细胞浸润：阴道镜和视频内镜分类显示C0、C1、C2分别占30.0%、50.0%、20.0%；宫颈PMN百分比呈明显右偏分布，中位数0%（四分位距（interquartile range, IQR），0–3%），均值5.21%（标准差14.10%），范围0–74%；按≥5%阈值，20.0%奶牛宫颈PMN升高。宫颈PMN百分比在C0、C1、C2间无差异（Kruskal–Wallis检验，p = 0.931），宫颈PMN≥5%比例分别为20.8%、20.0%、18.8%（Fisher精确检验，p = 1.000）。观察者内连续PMN百分比组内相关系数为0.96、二分类κ为0.92；观察者间分别为0.92和0.89。

3.3 繁殖阶段与宫颈中性粒细胞浸润：80头中黄体期42头（52.5%）、卵泡期34头（42.5%）、乏情4头（5.0%）；三组宫颈PMN百分比有差异（Kruskal–Wallis检验，p = 0.003），黄体期、卵泡期和乏情期中位数分别为0%（IQR，0–1%）、1%（IQR，0–10%）和0%（IQR，0–2%）。黄体期与卵泡期比较，卵泡期宫颈PMN百分比更高（Wilcoxon秩和检验，p < 0.001）；宫颈PMN≥5%在黄体期为9.5%、卵泡期为35.3%、乏情期为0%，卵泡期更常见（Fisher精确检验，p = 0.010），粗OR = 5.18（95% CI，1.49–18.04）；≥3%和≥10%阈值分析方向一致。

3.4 宫颈与子宫内膜中性粒细胞浸润的关系：宫颈与子宫内膜PMN百分比呈弱正相关（ρ = 0.240，p = 0.033）；有细胞学子宫内膜炎的奶牛宫颈PMN百分比更高（Wilcoxon秩和检验，p = 0.011）。宫颈PMN≥5%占20.0%，细胞学子宫内膜炎占31.3%；两种分类均阳性9头，仅宫颈PMN≥5%阳性7头，仅细胞学子宫内膜炎阳性16头；两种分类有关联（Fisher精确检验，p = 0.032），但一致性有限（Cohen κ = 0.258）。

3.5 宏观宫颈外观与子宫内膜中性粒细胞浸润：宏观宫颈外观与子宫内膜PMN百分比无关（Kruskal–Wallis检验，p = 0.155）；细胞学子宫内膜炎在C0、C1、C2中分别占16.7%、35.0%、43.8%，但关联无统计学意义（Fisher精确检验，p = 0.128）。

3.6 繁殖阶段与宫颈中性粒细胞浸润：在76头黄体–卵泡比较中，16头宫颈PMN≥5%。调整胎次和细胞学子宫内膜炎的分数logistic回归显示，卵泡期与宫颈中性粒细胞浸润正相关（β = 2.42；95% CI，0.81–4.03；p = 0.003），卵泡期与黄体期预测宫颈PMN百分比平均边际差为10.48个百分点（95% CI，1.42–19.54；p = 0.023）。两部分分析显示，卵泡期可检测到宫颈PMN的调整OR = 4.71（95% CI，1.73–12.82；p = 0.002），阳性观察中调整平均PMN比例比 = 4.11（95% CI，1.40–12.06；p = 0.010）。Firth惩罚logistic回归中，卵泡期宫颈PMN≥5%的aOR = 5.38（95% CI，1.39–20.83；p = 0.015）；胎次（aOR = 1.58；95% CI，0.87–2.89；p = 0.134）和细胞学子宫内膜炎（aOR = 2.24；95% CI，0.69–7.21；p = 0.178）未独立相关；模型总体Wald χ²(3) = 9.26，p = 0.026。≥3%和≥10%阈值分析方向一致（aOR分别为3.72和6.30）。调整DIM后，卵泡期与宫颈PMN≥5%的关联持续（aOR = 3.94；95% CI，1.15–13.50；p = 0.029），再调整胎次和细胞学子宫内膜炎后仍持续（aOR = 4.51；95% CI，1.09–18.64；p = 0.037）；分数回归调整DIM、胎次和细胞学子宫内膜炎后亦持续（β = 2.405；95% CI，0.542–4.269；p = 0.011），边际差10.82个百分点（95% CI，0.04–21.59；p = 0.049）。

3.7 繁殖随访：80头中65头（81.3%）在允许最多5次输精的繁殖管理程序内于约120天妊娠确认时达到妊娠，15头（18.7%）第5次服务仍未妊娠；有记录妊娠牛64头，每次受孕中位服务次数1（IQR，1–2）。探索性分析未检测到后续妊娠与宫颈PMN≥5%或细胞学子宫内膜炎的显著关联；宫颈PMN≥5%与未≥5%者妊娠比例分别为75.0%和82.8%，细胞学子宫内膜炎阳性与阴性者分别为80.0%和81.8%；子宫内膜PMN百分比连续变量与妊娠无显著关联（OR = 0.96；95% CI，0.91–1.01；p = 0.156）；基线血清孕酮经胎次调整与妊娠呈正相关（每增加1 ng/mL，OR = 1.13；95% CI，1.01–1.26；p = 0.030），但繁殖管理随初始繁殖阶段不同，不能脱离繁殖阶段或后续输精方案解释。

讨论总结：研究人员归纳三项主要发现：宫颈中性粒细胞浸润与繁殖阶段相关，卵泡期PMN百分比及升高频率高于黄体期，调整胎次和细胞学子宫内膜炎后仍存在，并在不同操作阈值和不同分析中一致；宏观宫颈外观与宫颈PMN浸润无关，提示可见宫颈变化与细胞学中性粒细胞浸润是不同特征；宫颈与子宫内膜PMN浸润正相关但相关性弱、分类一致性有限，不能互相替代。原文强调，横断面设计不能建立因果，也不能区分生理性白细胞运输与病理性炎症；卵泡期较高PMN不应解释为激素直接诱导宫颈炎；≥5%阈值未在45 DIM后奶牛中验证，应作为操作性指标而非宫颈炎确诊阈值。宏观C0–C2宜描述宏观外观，C2本身不应视为炎症性宫颈炎证据；宫颈PMN≥5%应描述为中性粒细胞浸润增加的操作性指标。宫颈和子宫内膜细胞学提供互补而非可互换信息。生殖结局分析为探索性，非妊娠牛仅15头且繁殖管理依赖基线阶段，不能据此认为炎症对生育无影响；Madoz et al.和Lee et al.等报道的亚临床子宫内膜炎（subclinical endometritis）与繁殖性能关系及阈值差异受群体、产后间隔、定义和管理影响。优势包括同次检查整合宏观外观、宫颈和子宫内膜细胞学、卵巢结构和孕酮，采用连续比例结局、两部分模型、阈值敏感性分析及盲法细胞学评估；局限包括横断面、单一人群、样本量有限、阈值未验证、不能外推至其他饲养管理和疾病负担牛群。结论翻译：产后放牧奶牛宫颈中性粒细胞浸润与繁殖阶段相关，而与宏观宫颈外观无关；卵泡期宫颈PMN百分比高于黄体期，调整胎次和细胞学子宫内膜炎后该关联持续；两部分分析支持卵泡期可检测PMN的比值更高且阳性观察中浸润更强；操作性PMN阈值二次分析方向一致。宫颈与子宫内膜中性粒细胞浸润正相关，但弱相关和有限一致性表明两部位细胞学发现相关但不可互换。调整DIM、胎次和细胞学子宫内膜炎后，繁殖阶段与宫颈PMN≥5%的关联持续。结果支持在繁殖阶段背景下并将宫颈PMN百分比作为连续指标解释，而非仅依赖未验证诊断阈值；宏观宫颈外观也不应视为宫颈中性粒细胞浸润的替代。该群体中未检测到宫颈或子宫内膜中性粒细胞浸润与后续妊娠的显著关联，但探索性发现应谨慎解释，因非妊娠牛数量有限且繁殖管理随基线繁殖阶段不同。需要采用标准化繁殖方案和纵向生育结局的研究，并开展纵向研究表征繁殖周期中宫颈中性粒细胞运输的生理变异及建立产后奶牛宫颈细胞学临床参考值。