鸭HERC3通过结合MAVS正向调控RIG-I/MAVS介导的IFN-β产生

《Animals》：Duck HERC3 Positively Regulates RIG-I/MAVS-Mediated IFN-β Production Through Interaction with MAVS

　　

RIG-I样受体（RLR）信号通路对于检测胞质病毒RNA并通过关键接头蛋白MAVS启动I型干扰素应答至关重要。尽管MAVS的调控在哺乳动物中已被广泛研究，但对其在禽类物种中的调控机制知之甚少。HERC3参与哺乳动物中RLR介导的免疫调控，但其在鸭中的功能尚未被探索。本研究探讨了鸭HERC3（duHERC3）在RLR信号通路中的功能。研究人员发现，duHERC3在所检测的所有组织中普遍表达，并在新城疫病毒（NDV）感染及3p-hpRNA刺激后显著上调。过表达duHERC3可升高MAVS和OASL的mRNA水平并增强IFN-β的产生，而敲低duHERC3则产生相反效应。免疫共沉淀（Co-IP）实验揭示，duHERC3与MAVS的N端结构域（aa5-175）发生相互作用。此外，duHERC3以RIG-I依赖的方式增强MAVS介导的IFN-β诱导，表明duHERC3通过经典的RIG-I-MAVS轴发挥作用。综上所述，研究结果表明，鸭HERC3通过与MAVS相互作用正向调控MAVS依赖的IFN-β产生，为禽类先天免疫的调控网络提供了新见解。

论文解读：鸭HERC3通过结合MAVS正向调控RIG-I/MAVS介导的IFN-β产生

一、研究背景与科学问题

先天免疫系统是机体抵御病毒感染的第一道防线，其中模式识别受体（PRRs）负责快速识别病毒入侵并启动抗病毒应答。在胞质PRRs中，视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）家族包含三个成员——RIG-I、黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）和遗传学与生理学实验室2（LGP2），是感知病毒感染的关键传感器。RIG-I作为胞质先天免疫受体，在RNA病毒感染的快速应答中发挥核心作用。当RIG-I结合病毒RNA配体后，其N端半胱天冬酶激活和招募结构域（CARDs）暴露并与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）上的同源CARDs相互作用，启动MAVS寡聚复合物的组装，进而促进转录因子IRF3和NF-κB向核内转位，最终产生I型干扰素和干扰素刺激基因（ISGs），执行抗病毒防御功能。

HERC3属于四个小HERC蛋白（HERC3-6）亚家族，包含一个N端RCC1样结构域（RLD）和一个C端HECT结构域。在哺乳动物中，HERC3可促进RelA蛋白降解，被认为是NF-κB介导炎症反应的候选调控因子。然而，HERC3是否通过其与RLR信号级联核心组分MAVS的相互作用来调控抗病毒先天免疫，尤其在禽类物种中，此前尚不清楚。

鸭是多种病毒（包括流感病毒）的重要自然宿主和储存库，通常表现为无症状感染且病理损伤轻微。绿头鸭对疾病普遍具有抵抗力，其早期而强烈的先天免疫应答能有效限制病毒复制并清除高致病性禽流感病毒，而相同毒株在人类、鸡及其他鸭种中则可引起严重的全身性感染甚至死亡。值得注意的是，RIG-I在鸭中呈组织特异性基础表达，而鸡似乎缺失RIG-I，转而通过相关的RLR成员MDA5检测甲型流感病毒。有趣的是，转染鸭RIG-I的鸡细胞能产生更多IFN-β，增强大量ISGs的表达并限制流感病毒。鉴于RIG-I在鸭抗病毒免疫中的关键作用，既往研究已表明鸭RIG-I-MAVS通路受多种调控因子的调节：鸭TRIM25在5'ppp dsRNA刺激下显著诱导并参与RIG-I介导的先天免疫激活；鸭TRIM29通过其C端结构域与鸭MAVS相互作用并以剂量依赖方式抑制IFN-β和IRF7启动子活性；鸭PHB1和PHB2通过靶向MAVS正向调控IFN-β产生。这些发现表明鸭已发展出多层调控网络来调节RLR通路以维持病毒感染期间的免疫稳态。然而，鸭HERC3是否调控RLR通路，特别是通过MAVS相互作用实现调控，仍属未知。本研究旨在探讨鸭HERC3在RIG-I-MAVS抗病毒信号通路中的调控作用。

二、研究设计与技术方法

研究人员以20日龄樱桃谷鸭为研究对象，随机分为两组，每组5只，分别经眶内途径接种含10⁵ EID₅₀新城疫病毒（NDV）F48E8强毒株的100 μL病毒液或等量磷酸盐缓冲液（PBS），攻毒后48小时采集各组织及血液样本。体外实验采用鸭胚成纤维细胞（DEFs），包括稳定表达EGFP的DEF^EGFP和稳定表达RIG-I的DEF^RIG-I细胞系。主要技术方法包括：通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测duHERC3、MAVS和OASL的mRNA表达水平；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量细胞培养上清中鸭IFN-β蛋白浓度；通过免疫共沉淀（Co-IP）结合免疫印迹分析鉴定duHERC3与MAVS及其截短突变体之间的蛋白相互作用；利用小干扰RNA（siRNA）技术敲低内源性duHERC3以评估其功能。

三、主要研究结果

3.1 病毒感染诱导鸭HERC3表达上调

NDV感染后鸭未表现明显临床症状或死亡，但剖检可见肝脏出血性病变。PCR检测证实感染组鸭均检出病毒核酸片段，对照组无扩增产物。duHERC3在所检测的所有组织中普遍表达。与对照组相比，NDV感染显著上调法氏囊、脾脏、胸腺、心脏、肺、肾、脑、腿肌、肝脏、肌胃和血液中duHERC3的表达，而十二指肠和胸肌中无显著变化。体外实验中，3p-hpRNA刺激后DEF^EGFP和DEF^RIG-I细胞中duHERC3表达均显著升高。

3.2 duHERC3过表达增加MAVS mRNA和IFN-β产生

在DEF^EGFP和DEF^RIG-I细胞中过表达duHERC3后，MAVS表达呈剂量依赖性增加，同时OASL表达显著升高。ELISA结果显示duHERC3剂量依赖性地促进IFN-β产生。此外，RIG-I增强了duHERC3诱导的MAVS、OASL和IFN-β表达。

3.3 敲低duHERC3抑制MAVS mRNA和IFN-β产生

研究人员设计了4条靶向duHERC3的siRNA，其中siduHERC3-3敲低效率最高并用于后续实验。在DEF^EGFP和DEF^RIG-I细胞中转染siduHERC3-3后，MAVS和OASL表达受到抑制，IFN-β产生亦减少。

3.4 duHERC3与MAVS的N端结构域相互作用

将duHERC3-HA与全长MAVS-FLAG及其截短突变体共转染DEF^RIG-I细胞后进行Co-IP实验，结果显示MAVS和MAVS（aa5-175）可在免疫沉淀复合物中被检测到，表明duHERC3与MAVS的N端结构域发生相互作用。

3.5 duHERC3增强MAVS依赖的IFN-β产生

在DEF^EGFP和DEF^RIG-I细胞中设置三种处理：单独过表达MAVS、MAVS过表达联合siduHERC3、MAVS过表达联合duHERC3。结果显示，与单独过表达MAVS相比，MAVS过表达联合duHERC3敲低时OASL表达无显著变化但IFN-β产生显著减少；而MAVS过表达联合duHERC3时OASL和IFN-β表达均显著升高。这表明duHERC3正向调控MAVS依赖的抗病毒信号以促进IFN-β产生。

四、讨论与结论

本研究表明duHERC3是RLR通路的一个新型正向调控因子。NDV感染在几乎所有检测组织中显著上调duHERC3 mRNA水平，尤其在脑和免疫器官（法氏囊、脾脏、胸腺）中升高明显。体外3p-hpRNA刺激同样显著升高duHERC3表达，提示duHERC3的诱导可能并非NDV感染特异性，而是宿主细胞对病毒RNA触发的先天免疫信号的普遍应答。Co-IP实验证实duHERC3与MAVS的N端结构域（aa5-175）相互作用。当MAVS过表达联合duHERC3敲低时，IFN-β表达显著降低，表明duHERC3诱导的IFN-β增加是MAVS依赖的。值得注意的是，在RIG-I存在的情况下，duHERC3与MAVS联合过表达导致IFN-β表达显著升高，而RIG-I是感知病毒RNA并启动下游MAVS介导信号级联的关键上游识别受体，这种协同激活效应提示duHERC3并非独立激活IFN-β通路，而是通过经典的RIG-I-MAVS信号轴发挥免疫调控功能。

研究结论：duHERC3在感染新城疫病毒的鸭组织中显著上调，尤其在免疫器官中表达升高明显。duHERC3与MAVS相互作用并增加干扰素刺激基因的mRNA水平及增强IFN-β产生。因此，duHERC3被鉴定为鸭RIG-I样受体（RLR）信号通路中IFN-β产生的正向调控因子。这些发现深化了对HERC蛋白在鸭先天免疫应答中分子调控机制的理解，推进了对禽类保护性免疫的认识，为禽类抗病毒防御机制研究及相关疾病防控策略开发提供了新见解。