日本血吸虫氨肽酶N（SjAPN）的功能分析及其在雌虫发育与生殖中的作用研究

《Tropical Medicine and Infectious Disease》：Functional Analysis of Schistosoma japonicum Aminopeptidase N

　　

中文摘要翻译 日本血吸虫氨肽酶N（SjAPN）是一种保守的M1家族金属蛋白酶，但其在血吸虫生物学中的功能尚不清楚。研究人员采用生物信息学分析、定量PCR、RNA干扰（RNAi）、共聚焦显微镜和扫描电子显微镜（SEM）等技术对SjAPN的表达与功能进行了表征。SjAPN含有典型的金属蛋白酶结构域，与其他吸虫的同源蛋白具有较高的序列相似性。其转录水平在血吸虫发育过程中逐渐升高，雌虫中的表达高于雄虫，且主要分布于两性虫体的前部区域。RNA干扰可有效降低成虫体内SjAPN的转录水平。功能分析表明，SjAPN沉默与体外培养期间虫卵产量降低、卵黄细胞染色改变以及雌虫体被表面结构变化相关。在体内实验中，SjAPN RNAi组的虫荷显著低于NC组，但与PBS组相比差异不显著。这些发现表明，SjAPN转录水平与日本血吸虫的发育和生殖生物学变化相关，尤其在雌虫中更为显著，并可能成为进一步研究血吸虫病防控的潜在靶点。这些表型是否由SjAPN蛋白丰度或酶活性的降低所介导，仍需进一步研究加以确定。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

血吸虫病是一种由血吸虫感染引起的重大寄生虫病，可对宿主的肝脏、肠道或泌尿生殖系统造成严重损害，主要表现为肝脾肿大、虫卵诱导的肉芽肿形成以及随后的组织纤维化。作为一种被忽视的热带病，血吸虫病在78个国家和地区的热带及亚热带地区流行，全球每年约有6亿人面临感染风险，超过1.2万人死于血吸虫病相关的慢性并发症和晚期疾病后遗症。

尽管大规模预防性化疗和综合防控策略近年来已降低了血吸虫病的疾病负担，但传播尚未被消除。中国正接近消除日本血吸虫病的目标，但钉螺孳生地的持续存在和再出现构成了传播复燃的风险。血吸虫病疫苗研发已持续60余年，但目前尚无商业化疫苗可用。吡喹酮仍是血吸虫病防控的首选药物，然而长期大规模使用引发了潜在的耐药性担忧。因此，开发能够减少感染、降低虫荷和减轻病理损害的疫苗，对于血吸虫病的长期防控和最终消除具有重要意义。

氨肽酶N（APN），又称CD13，是一种依赖Zn2?的II型跨膜外肽酶，广泛表达于哺乳动物细胞表面。作为M1金属蛋白酶家族成员，APN主要催化N端中性氨基酸（如丙氨酸和亮氨酸）的水解。在哺乳动物中，APN参与小肠肽消化、肾素-血管紧张素系统调控、细胞迁移、血管生成以及肿瘤侵袭和转移等多种生理和病理过程。近年研究表明，APN可能参与寄生虫的营养摄取、生长和发育，是抗寄生虫干预的潜在靶点。在捻转血矛线虫中，APN蛋白（即H11抗原）已被用作商业化疫苗的主要成分。基于此，研究人员选择APN作为研究对象，旨在通过RNA干扰（RNAi）技术探究其在日本血吸虫生长发育和生殖中的生物学功能。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用多种技术手段对SjAPN进行了系统研究。首先，基于SjAPN的氨基酸序列（GenBank登录号：TNN11936.1）进行生物信息学分析，包括保守结构域分析、理化性质预测、跨膜区和信号肽预测、N-糖基化位点预测、多物种同源序列比对、系统发育树构建以及SWISS-MODEL同源建模预测三维结构。其次，利用公开的曼氏血吸虫RNA-seq和单细胞RNA-seq（scRNA-seq）数据集分析同源蛋白的表达谱。再次，通过定量实时PCR（qPCR）检测SjAPN在不同发育阶段（18–42天感染期，dpi）和不同解剖区域（雌虫前部、卵巢、卵黄腺；雄虫前部、睾丸、后部）的表达模式。随后，设计三条特异性siRNA（S1、S2、S3）和一条非特异性阴性对照（NC）siRNA，在体外培养的成虫中进行RNAi效率筛选，并将最有效的S1 siRNA用于后续体外功能实验和体内干扰实验。体内实验中，感染小鼠自4 dpi起每4天经尾静脉注射siRNA，至42 dpi处死收集虫体。此外，采用Fast Blue BB染色结合共聚焦显微镜观察卵黄细胞形态，采用扫描电子显微镜（SEM）观察虫体体被表面结构。实验动物为6–7周龄雄性BALB/c小鼠，日本血吸虫中国株尾蚴由农业农村部动物血吸虫病重点实验室提供。

三、主要研究结果

3.1 SjAPN的生物信息学分析

SjAPN全长为4319 bp，开放阅读框为2715 bp，编码904个氨基酸，预测分子量为106.15 kDa，等电点为5.48。保守结构域分析显示SjAPN具有M1氨肽酶家族的两个特征性结构域，即M1_APN-Q样结构域（aa 107–562）和ERAP1_C结构域（aa 640–902），并含有活性位点和锌离子结合位点。序列特征预测表明SjAPN缺乏信号肽，但含有单个跨膜区（残基41–63），提示N端区域（1–40）位于细胞内，C端区域（64–904）位于细胞外。系统发育分析显示血吸虫属蛋白形成独立分支，SjAPN与湄公河血吸虫的假定蛋白亲缘关系最近，其次为曼氏血吸虫的氨肽酶PILS。多序列比对显示SjAPN与埃及血吸虫同源蛋白序列一致性为78.78%，与曼氏血吸虫两个同源蛋白分别为58.59%和54.07%，与插管血吸虫为52.40%，与茨氏鸟毕吸虫为53.73%，与湄公河血吸虫为49.09%，与捻转血矛线虫为26.97%。三维结构模型经Ramachandran图验证，92.35%的残基位于最适区域，QMEANDisCo全局评分为0.75 ± 0.05，GMQE评分为0.84，表明模型可靠。曼氏血吸虫同源蛋白（Smp_247070）的表达数据显示其在早期发育阶段表达较低，21 dpi后的童虫和成虫中显著升高，38 dpi的雌虫中表达最高，雄虫中相对较低。

3.2 SjAPN的表达模式

qPCR结果显示，SjAPN的转录水平随虫体发育逐渐升高，在大多数发育阶段雌虫的表达显著高于雄虫，尤其在25 dpi至42 dpi期间差异更为明显。在组织分布方面，雌虫和雄虫中SjAPN均主要在前部区域表达，卵巢、卵黄腺以及睾丸和后部区域的表达水平较低。这些结果表明SjAPN具有阶段依赖性表达特征，且在两性虫体的前部区域优势表达，雌虫中的表达尤为突出，提示其可能在血吸虫发育尤其是雌虫生殖生物学中发挥重要作用。

3.3 SjAPN转录敲低与雌虫发育的相关性

体外RNAi筛选实验中，S1和S3 siRNA分别将SjAPN转录水平显著降低62.12%和33.83%，其中S1的沉默效果最强，被选用于后续实验；而S2 siRNA反而使SjAPN表达显著升高，可能反映了脱靶效应或补偿性反应。体外功能实验中，与NC组相比，SjAPN RNAi组在96小时培养期间的总产卵量减少了33.77%。Fast Blue BB染色显示，RNAi组中71.43%（5/7）的雌虫出现卵黄腺异常，表现为染色显著减弱和腺体结构不连续，而NC组中仅为20%（1/5）。体内实验中，SjAPN RNAi组的虫荷较NC组显著降低29.26%，但与PBS组相比差异不显著（降低14.32%）。肝卵计数方面，SjAPN RNAi组较PBS组和NC组分别降低24.77%和10.09%，但差异均未达到统计学显著水平。各组间虫卵孵化率无显著差异。共聚焦显微镜观察显示，SjAPN RNAi组雌虫成熟卵黄细胞的荧光强度较PBS和NC组明显减弱，提示卵黄细胞发育受损。SEM观察显示，SjAPN RNAi组雌虫体被表面更光滑，棘和凹坑结构减少，尤其在前部区域更为明显，而雄虫未见明显形态变化。

四、讨论与结论

既往研究表明，多种寄生虫的APN与发育和营养获取密切相关，是潜在的抗寄生虫靶点。恶性疟原虫PfA-M1的抑制可破坏血红蛋白利用和寄生虫发育；艾美耳球虫EtAPN1参与卵囊成熟和孢子形成；弓形虫TgAPN2可能参与代谢和发育。捻转血矛线虫的APN（H11抗原）已被用作商业化疫苗成分。由于血吸虫和捻转血矛线虫均为吸血寄生虫，SjAPN可能参与肠道消化或宿主-寄生虫互作过程，具有作为疫苗候选或药物靶点的潜力。

SjAPN在雌虫和虫体前部的优势表达，结合RNAi介导的转录敲低后观察到的表型变化（包括虫荷降低、雌虫体被表面结构改变和卵黄发育异常），表明SjAPN可能参与营养利用、发育和生殖过程。然而，由于研究未检测SjAPN蛋白丰度和酶活性，这些表型应被解释为与SjAPN转录敲低相关的表型结果，而非蛋白功能直接降低的证据。肝卵负担的降低未达统计学显著，提示该基因可能主要参与卵黄腺的形态发育或细胞分化，而非在虫卵形成或胚胎发育中发挥直接且必需的作用，也可能存在补偿机制或样本量不足导致的统计效力受限。

从疫苗角度而言，吸血寄生虫的肠道和表面相关分子常包含所谓的隐蔽抗原，这类分子在自然感染中不易被宿主免疫系统识别，免疫选择压力较弱，但在摄食和营养摄取过程中可能暴露，是颇具吸引力的疫苗或药物靶点。捻转血矛线虫的H11抗原已被证实是定位于寄生虫消化道的隐蔽抗原。作为H11的同源蛋白，SjAPN若确为参与肠道消化或吸血的膜相关或表面相关蛋白，其隐蔽抗原特性值得进一步研究。

综上所述，SjAPN在日本血吸虫中具有重要的生物学意义。其在雌虫和虫体前部的优势表达，以及RNAi介导的转录敲低后观察到的虫荷降低、雌虫表面结构和卵黄发育的改变，表明SjAPN可能参与营养利用、发育和生殖过程。这些发现凸显了进一步研究其作为血吸虫病防控疫苗候选或药物靶点的价值。