携带保守染色体II scrA-scrK-scrB蔗糖利用区的黄色菌落AHPND相关副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）基因组特征

《Fishes》：Genomic Characterization of a Yellow-Colony AHPND-Associated Vibrio parahaemolyticus Carrying a Conserved Chromosome II Sucrose-Utilization Region

　　

急性肝胰腺坏死病（acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND）与携带编码PirA/PirB毒素的pVA1型质粒的弧菌属（Vibrio spp.）相关，但基于培养的筛查可能受到硫代硫酸盐–柠檬酸盐–胆盐–蔗糖（thiosulfate–citrate–bile salt–sucrose，TCBS）琼脂上非典型菌落颜色的影响。本研究对一株从泰国养殖凡纳滨对虾（Penaeus vannamei）中分离、表现为黄色菌落的AHPND相关副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）菌株25-018进行了表征，所用方法包括TCBS菌落观察、API 20E蔗糖试验、物种特异性及毒素基因聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、全基因组测序、抗菌药物敏感性试验和对虾攻击试验。在TCBS琼脂培养和API试验中，菌株25-018与一株非AHPND的溶藻弧菌（V. alginolyticus）对照株形成黄色菌落且为蔗糖阳性，而AHPND相关副溶血性弧菌和坎贝氏弧菌（V. campbellii）对照株形成绿色菌落且为蔗糖阴性。菌株25-018的5.58 Mb基因组含有一个完整的4027-bp染色体II scrA-scrK-scrB区域，与蔗糖阳性副溶血性弧菌的对应区域具有98.14%的核苷酸一致性，并含有一个携带pirA和pirB的69,082 bp pVA1相关质粒。染色体耐药决定因子包括bla_CTX-M-55和bla_CARB-21，且该分离株对氨苄西林和头孢吡肟耐药。对凡纳滨对虾（P. vannamei）和斑节对虾（P. monodon）的实验性暴露产生了与AHPND一致的肝胰腺病变。这些结果表明，AHPND相关副溶血性弧菌中可出现黄色菌落形成，且仅凭TCBS菌落颜色不应将分离株排除在进一步分子评估之外。

AHPND（急性肝胰腺坏死病）与携带pVA1型质粒并编码PirA/PirB毒素的弧菌属相关，但基于培养的筛查可能受TCBS（硫代硫酸盐–柠檬酸盐–胆盐–蔗糖）琼脂上非典型菌落颜色影响。传统上，多数副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）不利用蔗糖而呈绿色菌落，黄色菌落常被初步归为其他蔗糖利用型弧菌；因此，仅依赖TCBS菌落颜色可能在分子鉴定前排除黄色菌落，影响AHPND监测中后续毒素基因检测和致病性评估。研究人员对从泰国Chanthaburi养殖P. vannamei中分离的黄色菌落AHPND相关V. parahaemolyticus菌株25-018进行表征，并与非AHPND溶藻弧菌（V. alginolyticus）、AHPND相关V. parahaemolyticus及AHPND相关坎贝氏弧菌（V. campbellii）对照株比较，旨在明确黄色菌落的基因组基础及其对培养筛查和基因组监测的意义。研究结论表明，AHPND相关V. parahaemolyticus可出现黄色菌落，TCBS菌落颜色不能单独用于排除V. parahaemolyticus或AHPND相关弧菌；培养监测应保留非典型颜色菌落并进行分子确认。该研究将菌落表型、染色体蔗糖利用区、pVA1相关毒力质粒和耐药决定因子联系起来，对AHPND诊断流程具有直接提示意义。

关键技术方法概括：菌株25-018于2025年3月从泰国Chanthaburi养殖的P. vannamei中分离，由Chulalongkorn University Faculty of Veterinary Science提供；比较菌株包括Va non-AHPND 25-035A2-Y2、VpAHPND 13-028/A3和VcAHPND 16-904/1。关键技术包括TCBS菌落观察与API 20E蔗糖试验、物种特异性及pirA/pirB PCR、全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）与比较基因组分析、平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、Kaptive血清分型、VFDB（Virulence Factor Database）和CARD（Comprehensive Antibiotic Resistance Database）-RGI分析、纸片扩散法抗菌药物敏感性试验，以及P. vannamei和P. monodon攻击试验、攻毒后PCR检测和组织病理学检查。

研究结果如下。3.1 菌落颜色、生化特征与分子鉴定：25-018与Va non-AHPND在TCBS琼脂上形成黄色菌落且API 20E蔗糖（SAC）反应阳性，VpAHPND与VcAHPND形成绿色菌落且SAC阴性；物种特异性PCR结果与 designated species 一致；25-018、VpAHPND和VcAHPND均检出pirA和pirB，Va non-AHPND未检出；25-018原菌液、肉汤培养及分别挑取的黄色菌落均检出pirA和pirB。3.2 抗菌药物敏感性：25-018对甲氧苄啶–磺胺甲噁唑、氨苄西林–舒巴坦、头孢西丁、亚胺培南和氯霉素敏感；对四环素、阿米卡星、环丙沙星、头孢他啶和美罗培南中介；对氨苄西林和头孢吡肟耐药，总体对青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和四环素类等多种药物表现为非敏感。3.3 基因组特征：3.3.1 基因组组装与分类确认：完整基因组为5,583,149 bp，含两条环状染色体和两个质粒，总G + C含量45.3%；染色体1为3,444,964 bp，染色体2为1,989,527 bp，p25-018-1为79,576 bp，p25-018-2为69,082 bp；预测5153个基因，包括4901个蛋白编码序列、133个tRNA基因、37个rRNA基因、4个ncRNA基因和78个假基因；ANI分析最接近V. parahaemolyticus PNUSAV007146，ANI为98.6%、覆盖83.9%，支持25-018为V. parahaemolyticus。3.3.2 质粒特征：p25-018-1与Vibrio sp. 0908质粒p0908高度相似，查询覆盖95%、核苷酸一致性98.2%；p25-018-2携带pirA和pirB，分别位于互补链14,913–15,068和13,110–14,426位，与GenBank中AHPND相关弧菌对应序列100%一致；该质粒缺乏既往与墨西哥/中美洲AHPND质粒相关的Tn3样转座子，更接近亚洲型pVA1相关质粒。3.3.3 计算机血清分型与MLST：Kaptive分析将O抗原归为O1血清群，序列一致性99.7%、覆盖100.0%；荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）位点归为KL106，一致性100.0%、覆盖99.9%，但KL106尚未对应明确K血清群，故定为O1:KUT；MLST与ST-681共享7个管家基因中的6个等位基因，recA位点未匹配已知等位基因，故定为ST-681-like。3.3.4 毒力相关基因与耐药决定因子：VFDB比较仅检出热不稳定溶血素基因tlh，未检出tdh和trh；检出与黏附、定植、运动和环境适应相关的MSHA菌毛、IV型菌毛、CPS及III型分泌系统1（type III secretion system 1，T3SS1）组分，未检出T3SS2相关基因；CARD-RGI在染色体中检出adeF、TxR、tet(B)、tetR、CRP、parE和vanT等，并检出超广谱β-内酰胺酶基因bla_CTX-M-55和bla_CARB-21；质粒中未检出抗菌药物耐药基因。3.4 蔗糖利用区比较基因组特征：染色体II 1,552,591–1,556,617位存在完整4027-bp scrA-scrK-scrB区域，三基因位于反义链，预测蛋白分别为483、337和484个氨基酸，无移码或内部终止密码子；该区域与蔗糖阳性V. parahaemolyticus 16-VB00198对应区域核苷酸一致性98.14%，与V. alginolyticus ATCC 33787同源区域一致性97.04%；ScrA、ScrK、ScrB与16-VB00198的氨基酸一致性分别为99.17%、97.92%和99.59%，与V. alginolyticus分别为98.96%、96.74%和97.93%；相邻scrR调控基因和推定孔蛋白基因也高度保守，而蔗糖阴性V. parahaemolyticus ATCC 17802缺乏该簇；约7.75 kb同源区G + C含量为43.85%，低于染色体II的45.26%。3.5 实验致病性、攻毒后检测与组织病理学：P. vannamei攻击试验中，对照组48 h内无死亡，攻击组死亡1/8，死亡率12.5%；24 hpi组织病理显示对照组肝胰腺结构正常，攻击组出现肝胰腺小管上皮细胞脱落及管腔内上皮细胞碎片，符合急性期AHPND。P. monodon攻击试验中，对照组无死亡，攻击组8尾中6尾死亡，死亡率75%，首次死亡于13 hpi，67 hpi后至208 h观察期结束无新增死亡；7份攻毒后死亡样本均检出pirA和pirB；24 hpi组织病理显示对照组正常，攻击组出现上皮细胞脱落和管腔内上皮碎片。

讨论部分总结：本研究突出TCBS菌落颜色与分子鉴定之间的诊断相关不一致。25-018虽形成黄色菌落并携带染色体蔗糖利用区和pVA1相关pirA/pirB，但仍被鉴定为V. parahaemolyticus，说明TCBS颜色不能单独排除V. parahaemolyticus及AHPND相关弧菌。AHPND并不限于V. parahaemolyticus；Dong et al.报道harveyi-like Vibrio、V. owensii和V. campbellii等也可携带AHPND相关毒力决定因子，并指出AHPND相关弧菌可有绿色或黄色菌落，监测时应考虑两种颜色。本研究的四菌株比较显示，AHPND相关状态并不预测单一TCBS菌落颜色。25-018的黄色菌落和SAC阳性与其高度保守的scrA-scrK-scrB簇一致；Hammerl et al.曾实验证明来自16-VB00198的scrA-scrK-scrB簇可使蔗糖阴性V. parahaemolyticus和V. vulnificus获得蔗糖利用能力，本研究的高保守性为该表型提供了基因组基础。该区域与V. alginolyticus同源区高度相似、在蔗糖阴性参考株中缺失且局部G + C含量较低，支持水平获得假说，但精确插入边界、供体谱系和进化历史尚未确定。25-018还携带含pirA/pirB的pVA1相关质粒；pVA1型质粒具有可移动性，但本研究不能推断其获得供体、时间和方向。讨论强调，基于培养的监测应保留每种主要形态的代表性菌落，独立确认物种身份后再检测AHPND相关靶标，这与WOAH诊断框架中细菌分离、核酸检测、组织病理学和确认性扩增子测序互补的原则一致。25-018的β-内酰胺类耐药表型与bla_CARB-21和bla_CTX-M-55一致，bla_CTX-M-55的染色体定位提示其整合历史和长期维持值得进一步研究；美罗培南中介尚未被现有结果完全解释，需进一步评估通透性、外排或基因调控。研究局限包括仅为分离株水平表征、不能估计黄色菌落AHPND相关V. parahaemolyticus的流行率，动物实验每组仅两个缸重复，虾规格、暴露条件和观察期差异限制两种虾易感性直接比较，且未确定单个序列差异的功能效应及该区域精确进化史。

研究结论翻译：本研究整合基因组、表型和组织病理学结果，表征了菌株25-018——一株在pVA1相关质粒上携带pirA和pirB的黄色菌落AHPND相关V. parahaemolyticus。其非典型菌落颜色和蔗糖阳性反应与染色体II上高度保守的scrA-scrK-scrB蔗糖利用基因区相关，该区域与既往描述的蔗糖阳性V. parahaemolyticus密切 related。该分离株还携带染色体抗菌药物耐药决定因子，包括bla_CTX-M-55和bla_CARB-21，并在实验暴露后产生与AHPND一致的肝胰腺病变。这些结果表明，TCBS琼脂上的黄色菌落形成不能排除V. parahaemolyticus或AHPND相关弧菌属；因此，基于培养的监测应保留非典型颜色菌落并进行适当分子确认，尤其是在筛查AHPND相关弧菌时。