《Fishes》：Characterization of the Complete Mitochondrial Genome of Liobagrus aequilabris: Phylogenetic and Taxonomic Insights into Liobagrus
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摘要翻译：Liobagrus（鲇形目：Amblycipitidae，急流鲇类）是分类学上具有挑战性的一个属。其形态学鉴别特征不稳定，物种界限存在争议。本研究对两尾 L. aequilabris 个体的完整线粒体基因组进行测序、表征，并与同属线粒体基因组比较。线
摘要翻译：Liobagrus（鲇形目：Amblycipitidae，急流鲇类）是分类学上具有挑战性的一个属。其形态学鉴别特征不稳定，物种界限存在争议。本研究对两尾 L. aequilabris 个体的完整线粒体基因组进行测序、表征，并与同属线粒体基因组比较。线粒体基因组为双链环状分子，呈现典型脊椎动物组织（13个蛋白质编码基因（PCGs）、2个核糖体RNA（rRNAs）、22个转运RNA（tRNAs）和控制区（D-loop）），具有AT富集组成，并显示所有PCGs存在强纯化选择证据（Ka/Ks < 1），密码子水平分析仅在少数位点检测到偶发性正选择，主要位于ND4（NADH脱氢酶亚基4）和ND5（NADH脱氢酶亚基5）。最大似然（ML）和贝叶斯推断（BI）树恢复Liobagrus为单系，包含两个强支持分支：Clade I（韩国和日本）和Clade II（韩国和中国北方，亚分支A；长江和东南沿海物种，亚分支B）。在亚分支B内，L. aequilabris及其近缘种的末端集合仍解析不足；两棵树拓扑等价，仅显示方向不同，不代表真实冲突。在本研究检查的命名种中，同种性和错误鉴定值得优先检验，尽管近期分化（包括伴随不完全谱系分选的快速辐射）和线粒体渐渗仅凭线粒体数据不能排除，强调需要基于核/全基因组标记和凭证标本鉴定的整合分类学。这些线粒体基因组为L. aequilabris未来种群、环境DNA（eDNA）和保护研究提供分子参考。
研究背景：Amblycipitidae（急流鲇类）是分布于南亚和东亚急流溪流的小型淡水鲇类。传统上该科被认为包含Amblyceps、Liobagrus和Xiurenbagrus三个单系属，但基于核基因和线粒体基因的分子系统发育研究提示该科可能非单系，现行分类未充分反映其演化历史。Liobagrus是科内分布最广的属，中国是其多样性中心，近年仍不断有新种描述，物种多样性可能被低估。该属物种形态保守、原始描述不准确且误鉴广泛，物种界定和系统发育重建困难。L. aequilabris是属内分布最广的种，见于长江流域和淮河，但其分类地位和形态诊断存在问题：原始描述主要依据胸鳍棘后缘无大型倒刺及上下颌等长，但后续调查发现“等长颌”不稳定，保存于福尔马林或乙醇可使多数标本下颌回缩，形成“上颌较长”假象，历史上L. aequilabris与L. styani常被混淆，主要按颌长相对长度区分，而该特征在保存材料中不可靠。因此其物种界限和系统位置仍不明确。Liobagrus物种受栖息地退化、水利设施、过度捕捞和入侵种威胁，部分种类被IUCN红色名录列为受威胁。澄清上述问题需要独立分子证据；完整线粒体基因组可提供大量直系同源基因，提高浅至中等深度解析度，并可从少量或降解标本获得，但线粒体数据不能替代物种级证据，因为线粒体渐渗和不完全谱系分选可使mtDNA谱系与物种历史脱耦。此前尚无L. aequilabris完整线粒体基因组报道，其在属内的系统位置未检验。本研究旨在表征L. aequilabris完整线粒体基因组、重建其在Liobagrus内的系统位置，并讨论分类与保护意义，同时强调在线粒体证据与形态及核数据整合前不宜提出正式分类变更。
研究人员开展的研究及结论意义：研究人员测序并组装了两尾L. aequilabris的完整线粒体基因组，与同属线粒体基因组比较，分析基因组组织、核苷酸组成、密码子使用、选择压力和系统发育关系。结果表明两基因组分别为16,513 bp和16,512 bp，具典型脊椎动物37基因结构；全基因组AT偏斜，13个PCGs均受强纯化选择，仅少数密码子位点检测到偶发正选择，主要在ND4和ND5。ML和BI均支持Liobagrus单系，并分为两个强支持分支，显示地理结构；但L. aequilabris及其近缘种所在末端链因线粒体分化异常低而未完全解析。研究提出同种性和错误鉴定值得优先检验，但近期分化（包括快速辐射伴不完全谱系分选）和线粒体渐渗不能仅凭线粒体数据排除，需核/全基因组标记、模式材料复查和更密采样开展整合分类。该研究首次提供L. aequilabris线粒体基因组分子参考，对后续种群遗传、eDNA和保护研究有意义，并强调分类不确定性对保护评估的影响。
关键技术方法（不超过250字）：样本于2026年6月1日采自安徽省石台县秋浦河（长江下游支流；30.117° N，117.641° E）笼捕2尾，凭证号AAAS20260601DH1和AAAS20260601DH2；依据原始描述、臀鳍鳍条数14和15（L. aequilabris范围13–17，低于L. styani 18–19）及cytb K2P距离（与3尾模式产地L. styani为4.05–4.44%，远大于43尾L. aequilabris的0.55–2.03%）鉴定为L. aequilabris。方法包括基因组DNA提取、DNBSEQ-T7双端150 bp测序、Fastp质控、SPAdes组装、MITObim迭代映射重建环状线粒体基因组、MITOS2注释及Geneious人工校正；PhyloSuite计算组成、RSCU（相对同义密码子使用度）和Ka/Ks，DnaSP 6.0以Nei–Gojobori法估计Ka/Ks，Datamonkey/HyPhy 2.5.101的MEME（混合效应进化模型）检测位点正选择；MAFFT比对13个PCGs并串联（11,382 bp，去除终止密码子），ModelFinder分区，IQ-TREE最大似然（ML）1000次bootstrap，MrBayes贝叶斯推断（BI）1千万代，iTOL可视化；MEGA 12.09计算K2P（Kimura双参数）遗传距离。
研究结果：
3.1 线粒体基因组特征：通过测序组装获得两尾L. aequilabris完整线粒体基因组（GenBank nos. QB038047和QB038048），分别为16,513 bp和16,512 bp的单一闭合双链环状分子；两基因组基因内容和排列几乎相同，故仅展示QB038047。二者均含鱼类线粒体基因组典型37个基因：13个PCGs、2个rRNAs、22个tRNAs和非编码D-loop。基因在链间分布不均，H链携带多数基因，ND6和8个tRNAs位于L链。12个PCGs以ATG起始，COX1以GTG起始；ND1、ATP8、ND4L和ND5以完整TAA终止，COX1和ND6以完整TAG终止，其余7个具不完全终止密码子，ATP6为TA，另6个为T。22个tRNAs长67–75 bp，tRNA-Cys最短，tRNA-Leu(UAA)最长；除tRNA-Ser(GCU)的DHU臂被简单环替代外均折叠为经典三叶草结构；12S rRNA长955 bp，16S rRNA长1666 bp。D-loop长897 bp，位于tRNA-Pro和tRNA-Phe之间，暂分为ETAS（扩展终止相关序列）、含CSB-F/E/D的CD（中央保守域）和含CSB-1/2/3的CSB（保守序列块）区，均为推定；基因组含10个短间隔（1–29 bp）和6个重叠区（1–10 bp），最长间隔位于tRNA-Asn与tRNA-Cys之间（29 bp），最大重叠位于ATP8与ATP6之间（10 bp）；最长间隔内检测到由12个核苷酸折叠成保守茎环的L链复制起点（OL）。上述结果表明该基因组结构与典型鱼类线粒体基因组一致，并首次为Amblycipitidae的D-loop亚域提供推定注释。
3.2 核苷酸组成与偏斜：通过组成分析发现该线粒体基因组明显AT偏倚（56.0% AT，44.0% GC），总体AT skew为0.090、GC skew为?0.284，提示A略多于T、C明显多于G。13个PCGs（11,391 bp）AT含量55.4%，AT skew 0.019，GC skew ?0.302；tRNAs（1561 bp）AT含量55.9%，是唯一GC skew为正（0.054）的主要区域；rRNAs（2621 bp）AT含量55.6%，AT skew显著为正（0.238）；D-loop最AT富集（66.5% AT），AT skew 0.032、GC skew ?0.213。PCGs中H链基因（10,878 bp）AT含量55.4%，AT skew 0.040、GC skew ?0.342，而唯一L链基因ND6（513 bp）方向相反（AT skew ?0.460；GC skew 0.523），反映链间突变压力差异。密码子位置分析显示AT含量在第一、第二、第三位分别为48.1%、59.7%和58.3%，AT skew由第二位?0.367增至第三位0.313，GC skew渐负（?0.034、?0.345、?0.593），第三位组成偏倚最强并贡献总体偏斜；ATP8最AT富集（58.9%），ND4L最低（50.5%），多数PCGs GC skew为负，ND2最显著（?0.497）。这些结果说明该基因组存在区域和链特异性组成偏倚。
3.3 密码子使用与选择压力：通过密码子使用和选择压力分析发现13个PCGs编码3791个氨基酸（不含终止密码子），亮氨酸最多（644个密码子，16.99%），半胱氨酸最少（29个，0.76%）。密码子使用强烈偏向A/C结尾：20种氨基酸中19种最频繁密码子以A或C结尾，异亮氨酸例外；RSCU值范围0.14–2.56，26个密码子RSCU > 1；最偏好5个密码子为CGA（2.56）、CUA（2.49）、CCC（2.06）、UCA（1.96）和GCC（1.91），均以A/C结尾，而相应U/G结尾密码子多被回避（如ACG 0.14、GCG 0.17、CGU 0.17、CCG 0.19、UUG 0.20）。终止密码子中UAA最频繁（2.67），UAG为1.33，AGA和AGG缺失；色氨酸偏好UGA（1.75）高于UGG（0.25），甲硫氨酸偏好AUA（1.50）高于AUG（0.50），符合脊椎动物线粒体遗传密码。所有PCGs的Ka/Ks远低于1，表明强纯化选择；Ks较均一，多为0.4–0.5（范围0.205–0.675），Ka较低但变异较大（0.005–0.038；均值0.021）。COX亚基和CYTB最保守，NADH脱氢酶亚基较高，ND5的Ka（0.036）和Ka/Ks（0.072）第二高；Ka/Ks以ATP8最高、COX1最低，基因组按选择性约束描述性排序为COX > CYTB > ND > ATP。MEME在9个PCGs的28个密码子检测到偶发性 diversifying selection，ND4最多（9个位点），ND5次之（6个位点），ATP8、CYTB、ND3和ND2未检测到显著位点。结果表明纯化选择主导PCGs演化，正选择仅局限于少数ND亚基密码子。
3.4 系统发育关系与遗传距离：通过ML和BI分析发现两树拓扑相似，多数基部节点支持值高；两者均强支持Liobagrus单系，以Akysis brachybarbatus和Xiurenbagrus dorsalis为外群。属内恢复两个100%支持的主要分支：Clade I含5个韩国和日本种（L. geumgangensis、L. hyeongsanensis、L. mediadiposalis、L. somjinensis和L. reinii）；Clade II含两个亚分支：亚分支A含两个韩国种（L. andersoni、L. obesus）加L. huaiheensis，后者作为唯一中国北方种以100%支持位于两韩国种之间；亚分支B含长江流域及中国东南沿海其余种。亚分支B内6条序列在两树中相邻关系相同，形成单链（L. marginatoides–L. nigricauda–L. aequilabris QB038048–L. aequilabris QB038047–L. anguillicauda–L. styani），但两树显示方向相反，仅反映未解析末端链的显示方向而非分支顺序差异。遗传距离分析显示属内种间距离变异大；亚分支B中L. marginatoides NC021122、L. nigricauda NC021407和两L. aequilabris序列间为1.5–2.9%，L. kingi NC020337与L. marginatus NC022923间为1.8%，这些值与属内种内距离相当或更小（两L. aequilabris间1.9%，两L. obesus间1.7%）；L. styani与上述三种距离为3.2–4.2%。上述低分化基于每种两个个体的有限采样，解释需进一步检验。
讨论部分总结：4.1 线粒体基因组特征方面，两基因组在Liobagrus中偏短（属内16,483–16,636 bp），具典型37基因；AT含量56.0%和AT-skew 0.090–0.094落在属内范围（54.1–57.0%和0.084–0.108），GC-skew为负（?0.284至?0.286），与属内其他基因组（?0.275至?0.313）一致。本研究主要新贡献是首次为Amblycipitidae注释D-loop亚域（ETAS、含CSB-F/E/D的CD和CSB-1/2/3），但这些元件基于跨科同源比较，应视为推定；这些特征与Hemibagrus velox近期线粒体基因组分析相似，提示为鲇形目科间共享。4.2 核苷酸组成与密码子偏倚方面，基因组强AT偏，D-loop最AT富集（66.5%）反映功能约束较低，PCGs的AT skew最弱（0.019）受选择约束，tRNAs唯一GC skew为正（0.054）因二级结构需GC丰富茎，rRNAs AT skew最正（0.238）与A丰富环一致；H链基因与ND6相反的偏斜反映脊椎动物中报道的链不对称突变和复制过程，并导致第三密码子位置偏倚最强；密码子使用强烈偏向A/C结尾，19/20氨基酸偏好A或C结尾，异亮氨酸例外，26个密码子RSCU > 1；A结尾偏好与脊椎动物线粒体PCGs已知偏倚一致，C结尾偏好更可能反映链特异组成偏倚；UGA高于UGG、AUA高于AUG符合标准脊椎动物线粒体遗传密码。4.3 选择压力方面，所有13个PCGs的Ka/Ks远低于1，表明强纯化选择；Ka/Ks将基因组按选择性约束描述性排序为COX > CYTB > ND > ATP，该排序基于点估计而无正式统计检验，与各复合体结构约束不同一致；COX1最保守，符合其作为演化最慢线粒体PCG和DNA条形码的地位；ATP8的Ka（0.038）和Ka/Ks（0.184）最高，提示约束松弛，ND5第二高；ND亚基相对COX和CYTB具有较高Ka和Ka/Ks也属典型，可能反映NADH脱氢酶复合体结构约束较弱；MEME检测到少数密码子偶发正选择，主要位于ND4和ND5，而全基因Ka/Ks远低于1，表明纯化选择主导，正选择局限于ND亚基个别密码子，与Barbonymus schwanefeldii报道一致。4.4 系统发育关系与遗传分化方面，ML和BI均恢复Liobagrus单系，多数基部节点和属内两个主要分支强支持；与先前Liobagrus和Xiurenbagrus形成独立于Amblyceps的分支一致；Clade I为韩国和日本种，Clade II为中国种加两个韩国种。拓扑具地理结构；原文暂解释为与日本列岛与大陆分离后 vicariance、以及更新世海平面周期中黄海周边排水反复破碎和重连一致，但非证明；类似谱系地理格局见于其他东亚淡水鱼，检验其是否适用于Liobagrus需在朝鲜半岛、黄海沿岸及邻近中国水系更密采样并开展祖先分布区重建和分化时间估计；原文指出朝鲜半岛在此期间与大陆相连，相关 vicariant 事件涉及日本列岛和黄海地区而非朝鲜半岛本身；当前采样地理有限且种内不均（如L. aequilabris仅两尾），扩散等替代解释尚不能评估。亚分支A中L. huaiheensis以100%支持位于两韩国种之间，暗示淮河与朝鲜半岛排水历史联系或跨黄海扩散，但分化低（K2P 6.0–7.6%），河流袭夺、海平面低时临时陆桥或不完全谱系分选不能排除，需更密采样区分。亚分支B含长江流域和东南沿海种，包括L. aequilabris及其近缘；其所在末端链未完全解析，6条序列（5个命名种）在ML和BI中相邻关系相同，形成单链，两树仅显示方向不同而非真实拓扑冲突；该末端链中除L. anguillicauda NC021602外一端物种集合由极短内部枝连接（如L. marginatoides在ML树中0.0002 substitutions per site），近零枝长反映序列间低遗传距离，原因在4.5讨论。4.5 分类学意义方面，末端链6条序列（5个命名种）遗传距离低（1.5–4.2%），产生近零内部枝和亚分支内拓扑不稳定。多种不互斥假设可解释低分化：同种性与三种名义种间距离（1.5–2.9%）相当于或低于种内距离（两L. aequilabris 1.9%，两L. obesus 1.7%）一致，但支持有限且每种仅两个个体，可能低估种内变异，线粒体距离阈值不能支持异名；错误鉴定因诊断特征不稳定和属内混淆史而可信，L. aequilabris保存标本颌长不可靠，与L. styani长期混淆，L. nigricauda胸鳍棘边缘在模式标本复查后修订；近期分化包括快速辐射伴不完全谱系分选可产生相同格局，但需多独立核位点检测，本研究无此类数据；线粒体渐渗可通过杂交和线粒体捕获产生相似mtDNA，只能以核标记评估，并表现为线粒体与核基因谱系不一致。上述假设不互斥，现有每种两个个体且仅线粒体序列的数据不足以区分。同种性和错误鉴定值得优先进一步检验，因二者与观察距离量级一致且受属分类史独立支持，但这不证明其比替代更可能；近期分化和线粒体渐渗同样可能，只有核或全基因组标记才能排除。因此原文提出整合分类学，结合线粒体数据与核标记（如全基因组SNPs）、模式材料复查及更密地理和种内采样，以区分四种替代。相同谨慎可能扩展至亚分支B之外：L. kingi NC020337与L. marginatus NC022923种间距离很小（1.8%），且胸鳍棘边缘在模式标本复查后修订、分布范围很相似，提示同种性、近期分化和错误鉴定等替代也应在此检验。4.6 保护意义方面，L. aequilabris及其同属种的分类混乱使保护规划复杂化；Liobagrus物种受栖息地退化、水利设施、过度捕捞和入侵种日益威胁，部分已列为受威胁（如L. obesus为 Endangered，L. chenghaiensis为 Critically Endangered）；L. aequilabris分布最广，跨长江和淮河流域；本研究仅代表一个地点两尾个体，不能确定该名义种为单一谱系还是多个谱系；若名义种包含多个谱系或误鉴标本，各谱系真实地理范围和种群状况将与现有假设显著不同，基于名义种的保护评估可能误导。所报道线粒体基因组提供L. aequilabris分子参考，将支持未来种群遗传、eDNA监测及非法贸易或误鉴标本鉴定；结合正在进行的形态和核分析，有助于Liobagrus修订的整合分类和更准确保护评估。
研究结论翻译：两尾L. aequilabris线粒体基因组显示典型脊椎动物结构和全部13个PCGs显著纯化选择证据，COX1最保守、ATP8最松弛。系统发育分析恢复Liobagrus为单系，两个主要分支显示清晰地理结构（日本–韩国 vs. 中国加两个韩国种）。由于异常低的线粒体分化，L. aequilabris与其近缘种间关系仍未解决。在本研究检查的命名种中，同种性和错误鉴定值得优先检验，但若无核或全基因组数据，近期分化（包括快速辐射伴不完全谱系分选）和线粒体渐渗不能排除。因此，整合分类学——结合核标记、模式材料复查和更密采样——对于该受威胁属的准确物种界定和保护评估至关重要。这些线粒体基因组为L. aequilabris未来种群、eDNA和保护研究提供分子参考。
