《Veterinary Sciences》：Isolation and In Vitro Evaluation of Yeasts from Mare’s Milk and Fermented Mare’s Milk for Probiotic Potential
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马乳和发酵马乳是益生菌（probiotics）筛选的酵母潜在来源。本研究评估了来自上述来源的23株酵母分离株的体外益生潜力。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）初步将15株鉴定为Kluyveromyces marxianus，4株为Pi
马乳和发酵马乳是益生菌（probiotics）筛选的酵母潜在来源。本研究评估了来自上述来源的23株酵母分离株的体外益生潜力。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）初步将15株鉴定为Kluyveromyces marxianus，4株为Pichia manshurica，2株为Pichia fermentans，1株为Saccharomyces cerevisiae，1株为Yarrowia lipolytica。研究人员评估了应激耐受、溶剂亲和力、自聚集（autoaggregation）、共聚集（coaggregation）、溶血活性（hemolytic activity）以及无细胞上清液（cell-free supernatant, CFS）介导的抗菌活性。相对活菌计数以同一4 h终点的相应对照计算，在0.3%胆盐暴露下平均低于6%，在pH 2下低于1%。pH 3和升高温度下的响应可变。溶剂亲和力范围为2.50%至95.07%，每种溶剂内分离株间差异显著（均p < 0.001）。4 h后自聚集范围为7.50%至95.40%。与Escherichia coli共聚集约55%，与Salmonella Enteritidis约49%，与Staphylococcus aureus约50%。10株分离株的上清液至少抑制一种指示菌，6株抑制全部三种。R3-4对Staphylococcus aureus的平均抑菌圈数值最大（19.3 ± 1.2 mm）。未观察到可检测的溶血。探索性五域评分突出R3-4（推定Yarrowia lipolytica）和四株推定Kluyveromyces marxianus分离株，但未表明在所有性状上均优越。这些表型谱为进一步筛选提供信息；分子确认、全面安全性评估和与马相关的功能验证仍属必要。
研究背景：益生菌（probiotics，适量给予时对宿主有益的活微生物）研究长期以细菌为主，酵母（yeasts）作为功能性食品和营养补充剂潜在候选亦受关注，其可能涉及肠道菌群互作、宿主免疫调节和拮抗不良微生物，但均需按菌株和用途验证。乳制品是酵母益生筛选来源，兴趣已从Saccharomyces boulardii扩展至非Saccharomyces物种，如Kluyveromyces marxianus；K. marxianus B0399的体外研究支持乳源相关酵母研究，但不能推定同种其他分离株具等效益处。马乳和酸马奶（koumiss）是潜在益生微生物来源，Lactobacillus casei Zhang的分离和功能表征提供了例证；近期研究记录koumiss相关酵母多样性及具发酵特性分离株，支持进一步研究。Saccharomyces cerevisiae制剂曾作为马饲料补充剂评估，但马乳和koumiss来源酵母用于马应用的适用性仍未充分表征，且来源本身不能建立宿主适应。因此本研究评估23株马乳和koumiss来源酵母的体外功能和初步安全相关表型，为后续马用研究提供依据。
研究人员对23株分离株进行MALDI-TOF MS初步鉴定，并评估应激耐受、溶剂亲和力、自聚集、共聚集、溶血活性和CFS介导的抗菌活性，构建五域探索性复合评分。结论显示分离株表型多样，评分突出R3-4（推定Yarrowia lipolytica）和四株推定K. marxianus；6株上清液抑制全部三种指示菌；未检出溶血，但不足以确立安全性。其意义在于为后续菌株水平安全性评估和马相关功能验证提供优先筛选表型框架，但不证明益生功效或安全性。
关键技术方法（≤250字）：关键技术包括MALDI-TOF MS初步鉴定；以相对活菌计数评估0.3%（w/v）胆盐、pH 2–6及30–45 °C应激耐受；溶剂亲和力、自聚集和共聚集测定；哥伦比亚血琼脂溶血活性检测；无细胞培养上清液（CFSs）琼脂孔扩散法检测对Escherichia coli、Salmonella Enteritidis和Staphylococcus aureus的抑制；五域探索性复合评分及相应统计比较。样本队列来源：40份中国临床健康泌乳母马马乳样本（2024–2026，采样前1个月未接受抗菌治疗）和10份中国不同生产场点发酵马乳样本（2025）。
研究结果：3.1 酵母分离株的分离与初步鉴定：MALDI-TOF MS将23株归入5种，Kluyveromyces marxianus最多（15/23，65.2%），其余为Pichia manshurica（4/23）、Pichia fermentans（2/23）、Saccharomyces cerevisiae（1/23）和Yarrowia lipolytica（1/23），鉴定分数9.088–9.605；形态观察显示种间细胞形状重叠，菌落表面质地和边缘更具区分度，同种分离株记录形态无明显差异；这些结果描述保留的分离株集合，不建立菌株水平遗传差异或源样本物种丰度。3.2 溶血活性：所有分离株在血琼脂上无绿色变色或透明圈，归为γ-溶血，未观察α-或β-溶血。3.3 酸、温度和胆盐胁迫下的相对活菌计数：pH 2下所有分离株平均低于匹配pH 7对照的1%，R3-4数值最高（0.848 ± 0.355%）但无显著成对差异；pH 3下S4-1均值最高（711.11 ± 856.57%），仅与R4-1差异显著；0.3%胆盐下均低于6%，26-1最高（5.12 ± 2.42%），成对比较经Holm校正无显著；35–45 °C下均低于100%，35 °C下S3-2和R3-4最高且与R8-2差异显著，40 °C下S3-2最高（13.68 ± 7.60%），45 °C下R10-3最高（1.38 ± 0.36%）且与R2-2差异显著；初始活菌浓度未验证限制分离株间比较。3.4 细胞表面疏水性和自聚集能力：各溶剂内疏水性差异显著（均p < 0.001），R8-2在二甲苯和乙酸乙酯中最高，R8-1在十六烷中最高，31-2在氯仿中最高；自聚集2 h为2.50 ± 3.87%至94.40 ± 1.92%，4 h为7.50 ± 3.41%至95.40 ± 1.63%，15/23株4 h超过90%，8-2最高但与其他超过90%者无显著差异；共聚集方面S5-1对Escherichia coli和Salmonella Enteritidis最高（约55%和48%），对Staphylococcus aureus多在40%–50%，R3-4和S3-4最高、R2-2最低。3.5 抗菌特性：10/23株上清液至少抑制一种指示菌，6株抑制全部三种；R3-4对Staphylococcus aureus平均抑菌圈最大（19.3 ± 1.2 mm），对Escherichia coli最高为S5-4，对Salmonella Enteritidis最高为S3-2和S3-4；各指示菌总体差异显著（p < 0.001），但因最小可达双侧p值为0.10，成对置换比较无论Holm校正前后均不显著，不能据此确立分离株间抗菌活性等效。3.6 酵母分离株探索性复合评分：R3-4最高（71.50），其后为R8-1（57.52）、25-2（54.25）、R8-2（52.93）和25-3（50.53）；评分仅总结特定权重下的相对表型，不建立跨性状一致优越性、益生功效或安全性。
讨论部分总结：K. marxianus最多与既往马乳制品报道一致，Pichia manshurica第二；比例反映形态引导的菌落选择而非源样本物种丰度；物种鉴定为初步，未进行ITS或D1/D2序列确认及菌株水平基因分型，不能排除重复分离同一菌株。γ-溶血仅提供初步安全信息，仍需抗真菌药敏、马生理温度生长、生物膜、宿主细胞毒性和基因组毒力/耐药筛查。应激响应随分离株和条件变化；相对活菌计数基于同一终点对照，初始接种量未验证及低或变异对照需谨慎解释，终点平板计数不能区分生长降低、细胞死亡或可培养性丧失；35和40 °C接近马正常体温范围，但需直接评估生理温度。疏水性和聚集为黏附潜力的间接指标，OD法共聚集不能区分物理共聚集与沉降或生长活力变化，需肠上皮细胞模型验证。讨论引述Wang et al.关于疏水性与自聚集弱负相关、Tomi?i? et al.关于Saccharomyces boulardii与Candida spp.菌株特异性共聚集受培养条件和时间影响，以及Keskin et al.关于橄榄油来源Yarrowia lipolytica分离株在溶剂亲和、聚集、胆固醇去除和抗氧化活性上的变异；这些仅提供背景，不能建立R3-4的等效功能。复合评分依赖指标和权重，不证明全优；四株推定K. marxianus均不抑制Escherichia coli或Salmonella Enteritidis，仅25-2和25-3抑制Staphylococcus aureus，而R3-4、R2-2、R4-1、S3-2、S3-4和S5-4上清液抑制全部三种，支持将个体功能谱与复合评分并列考虑。未来需分子身份确认、菌株特异性安全和马相关效益验证；未处理上清液活性不能归因于特定抗菌产物，需区分有机酸、残余培养基成分和其他分泌产物并评估宿主细胞相容性，还需明确酵母细胞、代谢物与常驻菌群互作及加工储存中的活力和功能稳定性。
研究结论（译）：23株酵母分离株表现出多样的初步体外表型。探索性复合评估与上清液抑制试验识别出重叠但不同的待进一步研究分离株。R3-4和其他抑制阳性分离株需确认上清液相关活性，而具有有利探索性复合评分的分离株需独立验证其功能性状。应用前需进行分子鉴定、菌株水平安全性评估和马相关研究。
