土耳其美人鱼发光杆菌杀鱼亚种KLC25菌株的首个全基因组特征及比较基因组学研究

《Veterinary Sciences》：The First Genome-Based Characterization of a Photobacterium damselae subsp. piscicida Strain KLC25 from Türkiye

　　

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（Photobacterium damselae subsp. piscicida，Pdp）是全球海水养殖中主要细菌性病原之一。本研究据研究人员所知，首次在来自不同地理区域的公开基因组背景下，对分离自土耳其的Pdp菌株KLC25进行比较基因组特征分析。平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）和数字DNA–DNA杂交（digital DNA–DNA hybridization，dDDH）分析支持将KLC25分类归属于P. damselae。全基因组系统发育将KLC25定位为与分离株MT1415（意大利）和DI21（西班牙）最近，而核心基因组系统发育将其与塞浦路斯菌株BIC8和希腊菌株GalP1聚类，揭示了全基因组与核心基因组方法在聚类上的差异。在KLC25中还检测到与pPHDP10、pPHDP70和pPHDPT3同源的质粒相关序列。对KLC25中预测的前噬菌体区域进行比较分析显示，其与来自不同Pdp菌株的噬菌体具有相似性，其中大多数区域与来自不同菌株的噬菌体表现出最高序列相似性。尽管毒力相关决定因子在分析基因组中高度保守，但抗噬菌体防御系统和获得性抗菌药物耐药基因表现出较大变异性。总体而言，本研究拓展了对Pdp基因组多样性和进化的认识，并为其致病性和流行病学的未来研究提供了宝贵资源。

美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（Photobacterium damselae subsp. piscicida，Pdp）是海水养殖中危害严重的细菌性病原，引起发光细菌病（photobacteriosis），可感染金头鲷（Sparus aurata）、欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax）和黄尾鰤（Seriola quinqueradiata）等经济鱼类，导致急性败血症、组织损伤、高死亡率与显著经济损失。自20世纪60年代首次鉴定后，该病原已呈全球传播；集约化养殖条件下暴发频繁，而现有控制措施效果有限。Pdp致病依赖Aip56（Apoptosis-Inducing Protein of 56 kDa，凋亡诱导蛋白56 kDa）、RTX（repeats-in-toxins）毒素、溶血素、磷脂酶、荚膜、外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）及铁获取系统等。比较基因组学可系统识别核心与附属基因组、抗菌药物耐药（antimicrobial resistance，AMR）决定因子、细菌防御系统、分泌系统、前噬菌体（prophage）等。公开Pdp基因组虽增加，但地理多样分离株的比较仍有限；不同养殖区菌株可能在整体遗传相似背景下携带不同基因组特征。因此，研究人员对土耳其分离的KLC25菌株进行全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS），并与不同地理区域公开Pdp基因组比较，以解析其系统发育、毒力相关决定因子、分泌系统、AMR基因、前噬菌体及细菌防御系统。研究结论支持KLC25属于P. damselae，并与Pdp共享保守基因组骨架而附属基因组存在多样性；该研究拓展了对Pdp基因组多样性与进化的认识，为致病性、流行病学及病害监测控制研究提供资源。

关键技术方法：KLC25分离自2025年土耳其商业海水养殖设施中用于金头鲷（S. aurata）幼体培育的育苗水。研究人员采用Illumina NovaSeq 6000平台150 bp双端测序（约50×覆盖度）进行WGS，完成组装、质量评估与多平台注释；将KLC25与24株公开Pdp及8株美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（P. damselae subsp. damselae，Pdd）基因组比较，采用ANI、dDDH和TYGS全基因组系统发育；以Panaroo进行泛基因组分析、IQ-TREE构建核心基因组系统发育、Jaccard距离和UPGMA分析附属基因组；并用DefenseFinder、AMRFinderPlus、ABRicate/VFDB和VirSorter2预测防御系统、获得性AMR基因、毒力因子和前噬菌体。

研究结果：
3.1 基因组组装、系统发育分析与基因组特征（Genome Assembly, Phylogenomic Analysis and Genomic Characterization）：WGS组装得到1090个contig、总长4,083,100 bp、N50 12,931 bp、GC含量40.96%，CheckM完整度99.97%；注释预测3741个蛋白编码序列（coding sequences，CDSs）、147个tRNA基因、23个rRNA基因、1个tmRNA、15个非编码RNA和1个CRISPR位点。与GalP1参考基因组BLASTn比较显示匹配序列分布于Chromosome I（3.25 Mb）和Chromosome II（1.22 Mb），符合Pdp双复制子组织。ANI为96.9%–99.98%，dDDH为74.1%–99.9%，均高于种界定阈值；全基因组系统发育将KLC25与MT1415（意大利）和DI21（西班牙）最相近。质粒比较显示KLC25 contig与pPHDP70（68.3 kb）和pPHDP10（18.4 kb）广泛匹配，与pPHDPT3（136.3 kb）匹配较不连续并分布于多个区域，表明其含与已知Pdp质粒同源的序列。
3.2 泛基因组分析与核心基因组系统发育（Pan-Genome Analysis and Core-Genome Phylogeny）：泛基因组含8398个基因簇，其中核心2162、软核心515、壳3095、云2626。核心基因组系统发育将KLC25与希腊GalP1和塞浦路斯BIC8最相近；基于Jaccard距离的附属基因组UPGMA聚类则将KLC25与DI21、MT3189、SNW-8.1和MT1415归为一簇。结果表明全基因组、核心基因组和附属基因组聚类存在差异。
3.3 防御系统与AMR决定因子（Defense Systems and AMR Determinants）：KLC25编码I、II、IV型限制–修饰（restriction–modification，RM）系统、CBASS（cyclic-oligonucleotide-based anti-phage signaling system，环状寡核苷酸抗噬菌体信号系统）、AbiEii、Gao_Mza、GAPS2、Belisama、DRT-1、6A_MBL、dGTPase、RloC、RosmerTA、Rst_Hydrolase-Tm、Rst_HelicaseDUF2290、ShosTA和Toutatis等。比较显示dGTPase存在于全部25株，RM与Toutatis各24株，Rst_Hydrolase-Tm 23/25、RloC 21/25、GAPS2 20/25、ShosTA 19/25、II型RM 17/25；CBASS、AbiEii、PD-Lambda-1及多种CRISPR-Cas仅2株，多个其他系统仅1株。AMRFinderPlus在KLC25中鉴定dfrA31（甲氧苄啶耐药二氢叶酸还原酶）和qnrVC5（喹诺酮耐药五肽重复蛋白）；其余Pdp中AMR基因分布异质，aph(3′)-Ia和sul2各4株，floR、aph(6)-Id和aph(3″)-Ib各3株，bla_GMA-1和tet(59)各2株，aadA2、catA2、dfrA1、qnrS2、tet(A)、tet(B)、tet(D)、tet(M)各1株。结论为防御系统存在保守核心与株特异辅助成分，获得性AMR呈菌株特异获得。
3.4 毒力相关因子（Virulence-Associated Factors）：KLC25预测主要毒力因子包括Aip56、RTX毒素、热不稳定溶血素、溶血素III、磷脂酶PLA1与YtpA；铁获取系统包括piscibactin受体FrpA、TonB–ExbB–ExbD复合体、血红素/氯化血红素ABC转运体HmuV、HutZ、HutX与CcmA–D及FeoB/FeoC；并检出荚膜多糖合成CapK、CpsD/CapB，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）组装LptA、LapB，外膜蛋白OmpA、OmpK、TolC，II型（GspC–K、GspS、GspL、GspD）、III型和VI型（VgrG、Hcp）分泌系统，IV型菌毛、菌毛、鞭毛操纵子及甲基接受趋化蛋白（methyl-accepting chemotaxis proteins，MCPs）。比较分析显示254个毒力相关基因中124个属于核心基因组并在所有菌株保守，表明毒力相关决定因子高度保守。
3.5 推定前噬菌体区域的比较分析（Comparative Analysis of Putative Prophage Regions）：VirSorter2在KLC25预测10个推定前噬菌体区域（P1–P10，725–14,699 bp）；对24株Pdp同样分析，13株含前噬菌体区域，共57个，经最佳匹配过滤保留39个代表性序列，大小698 bp（SNW-8.1_P1）至96,513 bp（DQ-SS1）。基于序列相似性的层次聚类分为10簇；KLC25前噬菌体分布于多个簇而非单一簇，显示异质前噬菌体库，多数与MT1415和MT3189聚类，其他簇与DI21、SNW-8.1和QMA共享；多数KLC25前噬菌体与MT1415和MT3189前噬菌体BLASTn相似性最高。

讨论部分总结：ANI与dDDH支持KLC25属于P. damselae；全基因组与核心基因组系统发育均将KLC25置于Pdp进化枝，但最近亲不同，附属基因组分析又将其与DI21、SNW-8.1、MT3189和MT1415归簇，反映不同基因组分区提供不同关系信号。NH-LM2和DQ-SS1在两种系统发育中均形成与其他Pdp分开的分支并与Pdd聚类，虽此前报道为Pdp，其位置需进一步研究。KLC25与pPHDP10、pPHDP70广泛相似，而与pPHDPT3匹配碎片化；这些质粒携带AIP56、piscibactin和III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）相关决定因子，但草图基因组碎片化使研究人员无法确定其是否组织为完整质粒复制子，pPHDPT3在体外可不稳定并随T3SS相关基因丢失，需长读长测序和质粒特异性研究。防御系统提示Pdp具多层抗病毒防御网络，dGTPase、RM、RloC、GAPS2、ShosTA和Toutatis的广泛保守提示其为核心抗病毒防御组成；RM通过序列特异性识别和降解外源DNA保护基因组，dGTPase通过耗竭胞内脱氧核苷酸池限制病毒DNA合成。防御系统常为附属基因组动态成分并可由水平基因转移获得，Pdp–噬菌体相互作用的生态和生物学意义需实验研究。AMR方面，KLC25仅含dfrA31和qnrVC5，获得性AMR在25株中分布异质，提示并非种级保守性状而是菌株特异获得；土耳其水产养殖许可磺胺嘧啶–甲氧苄啶和氟喹诺酮，监测dfrA31和qnrVC5对评估AMR传播重要；希腊Euvoia和MM52共享floR、sul2及多个氨基糖苷耐药基因，提示局部抗菌选择压力可能维持这些基因。毒力谱与Pdp已知保守致病库一致，Aip56可诱导宿主巨噬细胞和中性粒细胞凋亡，piscibactin和血红素介导的铁获取对宿主体内铁限制环境中的存活和增殖重要。前噬菌体内容与分布差异明显，KLC25的异质前噬菌体库可能是除保守染色体序列之外的基因组变异来源。

研究结论翻译：本研究首次对分离自土耳其的美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（Pdp）KLC25菌株进行基因组特征描述。研究结果表明，KLC25与Pdp共享保守基因组骨架，同时在附属基因组中表现多样性。dfrA31和qnrVC5的检测提示存在预测的获得性AMR决定因子，但其表型意义仍需进一步验证。全基因组比较分析可促进Pdp分离株间基因组相关性研究，并支持未来传播模式研究。总体而言，这些发现拓展了对本研究所分析25个Pdp基因组中基因组多样性的认识，并为未来致病性、流行病学和疾病控制研究提供了基础。然而，草图基因组（draft genome）的碎片化限制了基因组结构特征和AMR决定因子遗传背景的分辨率；因此建议采用长读长测序（long-read sequencing）以获得更完整的基因组组装。需要进一步纳入土耳其不同水产养殖生产系统和地理区域中更多Pdp分离株的基因组研究，以确定KLC25中观察到的基因组特征反映株特异变异还是Pdp种群中的更广泛模式。