本土内生 Peribacillus simplex NVC-PS3 的分离表征及其减少 baby maize 尿素施用并维持农艺表现的潜力

《Nitrogen》：Isolation and Characterization of Peribacillus simplex NVC-PS3 for Reducing Nitrogen Fertilizer in Baby Maize

　　

过量施用氮肥（nitrogen fertilizer）于 baby maize 生产可导致养分损失和环境退化，突出可持续养分管理策略的必要性。本研究旨在分离、表征并评价本土内生细菌 Peribacillus simplex 菌株 NVC-PS3 的植物促生潜力，以减少 baby maize 的氮肥需求。P. simplex NVC-PS3 基于形态、生理、生化和 16S rRNA 基因特征进行鉴定，并评估固氮酶活性（nitrogenase activity）和氮积累。随后采用随机完全区组设计（randomized complete block design, RCBD）四重复，在四种尿素施用水平（350、263、175和0 kg urea ha^?1）下评估其对 baby maize 生长和产量的影响。P. simplex NVC-PS3 在培养期间表现出高生理适应性、固氮酶活性和持续氮积累。种子接种改善了土壤肥力指标，包括土壤有机质（soil organic matter, SOM）、全氮（total nitrogen, TN）、有效磷（available phosphorus, AP）、交换性钾（exchangeable potassium, EK）和细菌丰度。接种植株还表现出增强的营养生长、叶绿素含量、生物量生产、产量构成、商品产量和营养品质。值得注意的是，接种结合尿素施用量减少25%所获得的农艺表现与全推荐尿素施用量无显著差异。该发现提示，在本试验条件下，P. simplex NVC-PS3 具有部分减少合成氮肥投入并维持作物生产力的潜力。然而，仍需开展涉及同位素氮示踪（isotopic N tracing）和生物固氮（biological nitrogen fixation, BNF）定量评估的进一步研究，以确认 N₂ 固定的贡献并验证该菌株的减肥潜力。

研究背景与问题：氮（N）是决定作物生产力的关键养分，baby maize（幼穗玉米，文中亦称 Baby Corn, BC；Zea mays L.）因生产周期短、经济价值高且兼具鲜食与加工用途而日益重要，其快速营养生长和持续养分需求使集约化生产大量依赖合成氮肥。长期过量且低效施肥会引发土壤退化、养分失衡、温室气体排放、硝酸盐淋失和土壤微生物多样性下降，并可能加速酸化、削弱有机质周转、抑制有益微生物群落和降低养分利用效率。本土内生固氮菌（native endophytic nitrogen-fixing bacteria, NENFB）可通过生物固氮（biological nitrogen fixation, BNF）将大气 N₂ 转化为植物可利用的 NH₄⁺，并兼具产激素、溶磷、解钾、产铁载体和增强抗逆等促生功能；源于本地作物的内生菌通常更具定殖与生态适应优势。Peribacillus 近年从 Bacillus 中分出，部分种类具固氮、溶磷、产激素和耐盐抗旱特性，但在田间尤其是热带农业生态系统中评价仍有限，越南等亚洲国家 baby maize 集约施氮也降低氮效率。因此，研究人员分离本土菌株并进行鉴定和减氮评价，以探索维持生产力并降低合成氮肥投入的生物学途径。

研究开展及意义：研究人员从健康 baby maize 根系分离获得菌株 NVC-PS3，经形态、生理、生化和 16S rRNA 基因分析鉴定为 P. simplex，并评价其固氮酶活性、氮积累及田间接种效应。结果表明，接种可改善土壤肥力指标、植株生长、产量构成和营养品质；在接种并减少25%尿素施用的情况下，所评价农艺表现与全推荐尿素量无显著差异。该研究提示该本土菌株可作为减少尿素投入、改善土壤生物肥力和维持 baby maize 生产力的潜在生物肥料候选，但减氮与固氮贡献仍需进一步验证。

关键技术与方法（不超过250字）：供试菌株来源于越南安江省 Cho Moi 实验田健康 baby maize 根系。研究人员经根表面消毒、匀浆和梯度稀释后于酵母浸出物甘露醇琼脂（yeast extract mannitol agar, YMA）分离纯化，开展菌落与细胞形态、革兰染色、氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、硝酸盐还原和柠檬酸利用等生化表征；进行 16S rRNA 基因扩增、测序、BLAST 比对和邻接法系统发育分析。以无氮培养基筛选固氮菌，采用乙炔还原法（acetylene reduction assay, ARA）测定固氮酶活性，并以 Nessler 试剂测定 NH₄⁺。制备约 1×10⁸ CFU mL^?1 种子接种物，开展两因素随机完全区组设计（randomized complete block design, RCBD）四重复田间试验，因素为接种与否及尿素 350、263、175、0 kg urea ha^?1，测定土壤性质、生长、产量构成和品质。

主要研究结果：
3.1 P. simplex NVC-PS3 的形态、分子与功能表征：通过 YMA 培养、革兰染色、16S rRNA 基因 PCR 扩增和 Nessler 试剂检测，菌落呈圆形、乳白色、不透明、光滑、凸起且边缘完整，细胞为革兰阳性杆状，PCR 获得约1342 bp 单一条带，Nessler 试剂由淡黄变橙，表明该菌具活跃氮代谢和产氨能力。
3.2 细菌分离株的形态特征和生长性能：通过比较10个分离株在 Ashby 甘露醇、NFb 半固体和 Burk 无氮培养基上的生长，所有菌株均为革兰阳性杆状，但 VR2（后鉴定为 NVC-PS3）在三种无氮培养基上均生长最强，显示较强耐缺氮适应能力，被选为后续候选。
3.3 所选细菌分离株的生化特征：通过氧化酶、过氧化氢酶、脲酶、硝酸盐还原和柠檬酸利用试验及不同 NaCl、温度和 pH 下生长评价，VR2 五项生化反应均阳性，并在最高4% NaCl、45 ℃及较宽 pH 范围保持生长，显示较广生理适应性。
3.4 P. simplex NVC-PS3 的系统发育分析：通过 16S rRNA 基因邻接法系统发育分析，NVC-PS3 与 P. simplex 菌株 LT4 以100% bootstrap 支持聚为一支，并与 P. huzhouensis MS2 相近，支持其鉴定为 P. simplex。
3.5 细菌培养期间固氮酶活性和氮积累：通过 ARA 和培养液氮浓度测定，固氮酶活性由第1天18.3升至第5天最高103 nmol C₂H₄ h^?1 mL^?1，随后下降；氮浓度由第1天5.85升至第7天46.7 mg L^?1后降至第10天39.9 mg L^?1，表明固氮酶活性峰值早于最高氮积累。
3.6 接种与尿素施肥对收获后土壤性质的影响：通过收获后土壤分析，接种显著提高 SOM、TN、AP、EK 和可培养细菌数，而土壤 pH 不受显著影响；尿素用量显著影响 pH、SOM、TN 和总细菌数，SOM 与总细菌数存在接种×尿素互作。
3.7 baby maize 营养生长对接种和尿素施肥的响应：通过15和30 DAS 株高、叶数、叶绿素（SPAD）和茎粗测定，接种显著提高30 DAS 株高、叶数、叶绿素和茎粗；尿素显著影响多数指标，350 kg ha^?1 下30 DAS 株高、叶数和叶绿素最高，茎粗在263 kg ha^?1 与350 kg ha^?1 相当；30 DAS 叶数和茎粗存在互作。
3.8 产量构成和生产力响应：通过收获期鲜穗、秸秆、苞叶、穗轴、花丝、穗数和商品产量测定，接种提高鲜穗重、生物量、穗数、穗产量、花丝产量、苞叶产量和可食穗轴产量等；350和263 kg urea ha^?1 处理生物量和产量最高，完全无氮显著降低各参数；鲜穗重、鲜秸秆重、穗产量和苞叶产量存在接种×氮互作。
3.9 营养品质对接种和尿素减施的响应：通过品质分析，接种提高蛋白质、脂质、氮、磷和钾含量，水分略降；尿素减施显著影响水分、蛋白质、脂质和氮含量，推荐量及减氮25%处理下蛋白质、脂质和氮较高，完全无氮显著降低品质；脂质存在接种×减氮互作。

讨论总结与研究结论翻译：讨论认为，形态、生化、分子和功能证据相互补充，支持 NVC-PS3 的分类鉴定及其代谢多样性、环境适应性和潜在促生功能；其较宽温度、盐度和 pH 耐受性有利于热带田间定殖。研究同时强调，ARA 测得的只是纯培养条件下的潜在固氮酶活性，未进行 nifH 检测/测序或全基因组分析，不能作为 N₂ 固定的分子确证，也未量化田间 BNF 对植物氮营养的实际贡献；其他促生机制可能参与但未直接测定，应视为潜在机制而非已证实解释。今后需结合 nifH/基因组分析、促生性状定量和 ¹⁵N₂ 掺入或 ¹⁵N 同位素稀释等示踪方法验证。结论翻译：本研究表明，P. simplex NVC-PS3 在实验室条件下表现生理适应性和固氮酶活性；田间种子接种改善土壤性质、植株生长、产量构成和 baby maize 营养品质；接种并减少25%尿素处理在评价农艺参数上与全推荐尿素量无统计学显著差异。然而，无显著差异并不确立等效或非劣效。因此，结果提示 NVC-PS3 在本试验条件下具有支持减少尿素施用的潜力。尽管结果提供固氮潜力证据，但 BNF 对植物氮营养的直接贡献未量化，其他促生机制也可能参与。仍需分子确认、同位素氮示踪及适当等效或非劣效分析，以阐明相关机制并验证减少25%尿素施用的可行性。