《Journal of Virology》：Engineering a low cytotoxicity recombinant rabies virus neurotracer via N-gene recoding
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基于病毒载体的示踪剂已被证明在神经回路绘制中具有重要价值。基于狂犬病毒（rabies virus，RV）的逆行跨单突触（retrograde trans-monosynaptic）示踪剂已被广泛用于描绘目标神经元群体的输入神经回路。然而，RV示踪剂的细胞毒性（
基于病毒载体的示踪剂已被证明在神经回路绘制中具有重要价值。基于狂犬病毒（rabies virus，RV）的逆行跨单突触（retrograde trans-monosynaptic）示踪剂已被广泛用于描绘目标神经元群体的输入神经回路。然而，RV示踪剂的细胞毒性（cytotoxicity）限制了其应用。在此，研究人员采用合成减毒病毒工程（synthetic attenuated virus engineering，SAVE）技术，通过密码子对去优化（codon pair deoptimization，CPD）对RV SAD-B19株的N基因进行重编码，以生成减毒RV示踪剂。研究人员在体外和体内检测了重编码RV示踪剂的特性。全长重编码N基因使病毒拯救（viral rescue）失败，而部分重编码N基因支持病毒成功恢复（viral recovery）。与其亲本相比，重编码RV跨单突触示踪剂表现出更低的细胞毒性，并标记更多输入神经元（input neurons）。它还能稳健表达蛋白，以可视化神经元形态（neuronal morphology）并操控神经回路活动（neural circuit activity）。总之，研究人员的工作生成了一种新的逆行跨单突触工具，补充了现有神经回路示踪剂。重要性：病毒载体在生物医学多个领域发挥重要作用。在神经科学界，基于狂犬病毒（RV）的逆行跨单突触示踪剂已被广泛用于绘制目标神经元群体的输入神经回路。然而，基于RV的示踪剂固有细胞毒性限制了其更广泛应用。在本研究中，研究人员利用合成减毒病毒工程（SAVE）技术重编码RV N基因，生成了一种减毒神经示踪剂（neurotracer），这将显著有益于未来神经科学研究。
论文解读：基于病毒载体的神经回路示踪是解析神经连接的重要手段。狂犬病毒（rabies virus，RV）具有N、P、M、G和L五个基因，基于RV的逆行跨单突触（trans-monosynaptic）示踪系统通过删除G基因（RV-delG）限制自主传播，并用EnvA包膜蛋白假型化、AAV（adeno-associated virus，腺相关病毒）辅助表达G蛋白及TVA受体和报告基因，使病毒仅进入特定起始神经元并经G蛋白反式互补实现逆行跨单突触标记。第一代RV示踪剂基于疫苗株SAD-B19，但其细胞毒性限制应用。既往策略包括基于CVS-N2c强毒株开发低毒示踪剂、用蛋白质水解技术（protein proteolysis technology，PPT）在N蛋白C端加入PEST降解结构域、以及删除L和G基因构建无毒示踪剂；这些策略虽降低毒性，却常严重损害跨单突触播散效率。理想示踪剂需同时具备低细胞毒性和高跨单突触效率，因此研究人员尝试用SAVE技术重编码RV N基因，以同时减轻细胞毒性并提升示踪效率。该研究成功获得低毒的重编码RV WWD，并证明其可标记更多输入神经元、稳健表达荧光蛋白和功能蛋白，为神经回路解析提供了新工具，也表明SAVE是优化RV工具的可行平台。关键技术方法（不超过250字）：研究人员基于小鼠基因组计算密码子对评分（codon pair score，CPS），对RV SAD-B19株N基因进行全长及三段分段重编码，构建并拯救重组RV；用B7GG、BHK-EnvA、TVA800和BHK21细胞制备和滴定G包膜及EnvA包膜RV。使用8周龄C57BL/6J小鼠及Thy1-cre（Jackson Laboratory，FVB/N-Tg(Thy1-cre)1Vln/J，stock number：006143）与C57BL/6J杂交小鼠；B7GG、BHK-EnvA、TVA800细胞由Prof. Edward M. Callaway提供，BHK21细胞（ATCC CCL-10）用于滴定。开展脑内M1/vCA1注射、生长曲线、免疫印迹、qPCR、RNA-seq（转录组测序）、全细胞膜片钳、光遗传和脑片成像计数。结果如下：重编码RV SAD-B19株N基因：研究人员将N基因分为三段分别重编码或保留原序列，计算密码子对偏倚（codon pair bias，CPB）；全长重编码N基因NDDD不能获救，六种部分重编码病毒中仅WWD和DWW获救。体外比较显示WWW病毒产量最高，DWW高于WWD；WWD在3 dpi转录仍较低，蛋白表达在1 dpi低于WWW而后升高，故研究人员聚焦WWD作为减毒示踪剂候选。重编码RV WWD较其亲本WWW对神经元细胞毒性更低：研究人员向小鼠M1区注射等剂量G包膜WWD和WWW，1—4 wpi计数mNeonGreen阳性神经元，WWD组荧光神经元1—2 wpi增加、2—4 wpi减少，而WWW组1—4 wpi持续减少；RNA-seq显示WWW较PBS（磷酸盐缓冲液）有2184个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中1452个为WWW独有、149个为WWD独有；WWW上调1908个、下调276个转录本，WWD上调700个、下调181个；WWW显著上调免疫相关转录本，WWD中这些转录本显著降低或无显著变化，RT-qPCR验证一致；基因本体（Gene Ontology，GO）分析中WWD富集类别显著减少，WWW前20位GO主要与免疫反应相关，WWW转向白细胞介导免疫和适应性免疫，WWD转向稳态细胞和结构事件；2 wpi的bulk RNA-seq亦显示WWD的DEGs、GO及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）免疫/抗病毒通路富集少于WWW，表明WWD免疫原性低、宿主转录扰动少。感染WWD的神经元保留正常生理活动：研究人员在M1区注射WWD和WWW，2 wpi行全细胞记录，WWD感染组与未感染组在Rs、RMP（静息膜电位）、AP（动作电位）阈值、AP幅度和rheobase上无显著差异；WWW感染组膜封接成功率为0/10，WWD为10/10，对照为6/6；WWD-ChR2-mNeonGreen注射后2 wpi，473 nm光照可在急性脑片诱发AP，7和14 dpi记录显示ChR2（channelrhodopsin-2，通道视紫红质-2）表达有效性增加，表明WWD可递送功能蛋白操控神经活动。重编码RV WWD较其亲本WWW标记更多输入神经元：研究人员在Thy1-cre小鼠vCA1（腹侧海马CA1）注射两种辅助AAV，2周后注射EnvA包膜WWD和WWW，2 wpi计数；WWD组总初级神经元和总输入神经元均多于WWW，PIR（piriform cortex）、ENT（entorhinal cortex）、NDB（diagonal band nucleus）、MS（medial septal nucleus）和RE（reuniens thalamic nucleus）五个代表性输入区中WWD标记神经元数亦更多，表明减毒WWD扩展示踪时间窗并标记更多输入。重编码RV WWD可稳健表达mNeonGreen显示神经形态：研究人员将G包膜WWD注射M1区，14 dpi成像，mNeonGreen阳性神经元胞体和纤维形态清晰，高倍可见树突棘等细结构，表明其可稳健表达荧光蛋白显示神经元形态。讨论部分总结：原文提出理想神经回路示踪剂应具备足够减毒以延长功能分析窗口、高跨单突触效率、可表达荧光蛋白和功能蛋白、便于细胞系生产、便于动物注射等特征。既往降低RV毒性策略包括删除或降解病毒蛋白、CVS-N2c株、SiR示踪剂、删除L/G基因等，但常降低播散效率；增强播散策略包括G蛋白嵌合、密码子优化或密码子对重编码、单AAV辅助等，Sumser et al.还通过细胞系提高滴度。该研究用SAVE降低SAD-B19 N基因毒性，重编码N基因核苷酸序列不同但氨基酸序列相同；仅WWD和DWW获救且效率低于WWW，机制尚未完全阐明，可能涉及RNA二级结构/稳定性、核糖体对同义tRNA兼容性、稀有密码子、CpG和UpA频率增加等；转录组显示WWD免疫激活反而降低，生长曲线显示其复制较慢，从而毒性较低。N基因451—900 bp区域重编码病毒不可存活，原文认为可能与该区域功能motif、翻译暂停和核糖体停滞有关。与现有示踪剂相比，WWD保留一定细胞毒性，约2—3周跨突触标记窗口；在本实验条件下播散效率高于野生型，且异源基因表达强，不需重组酶放大。降低复制动力是双刃剑，但WWD仍满足跨突触示踪的最低阈值。既往第一代SAD-B19示踪剂多在感染1周内取脑，该研究将WWD感染时间延长至2周，仍标记更多输入并显示形态。研究结论翻译：综上，研究人员证实了SAVE技术降低RV示踪剂细胞毒性的优势，这将大大有益于进一步神经科学研究。此外，研究人员有理由相信，使用SAVE技术重编码其他RV基因可进一步降低RV细胞毒性，这也可能用于减毒其他RV毒株和其他病毒示踪剂。
