正文
反义寡核苷酸（ASO）疗法已从一种小众手段发展成为经临床验证的药物类别，目前已有十几种药物获批，还有更多药物正在推进临床前和临床研发管线。每一个项目都依赖于一种看似简单的成分：阴性对照ASO——它将候选寡核苷酸的序列特异性活性与其化学修饰及递送方式的影响区分开来。在实际操作中，研究人员通常为每个新候选物即兴设计一个乱序或错配的对照，这种方法很少得到充分表征，且可能具有不可预测的生物学活性。在《分子疗法核酸》（Molecular Therapy Nucleic Acids）本期刊中，De Bruycker及其同事直接针对这一空白展开研究，从数亿条计算机生成的序列中筛选出一组候选对照ASO。随后，他们对幸存的候选物——一种市售ASO和两个用于临床前研究的对照ASO——在七种细胞模型中进行了"压力测试"，采用的检测手段包括细胞活力、转录组学、蛋白质组学和成像分析。他们报告了三种位阻阻断型2'-MOE（2'-O-甲氧乙基）/PS（硫代磷酸酯）对照ASO，在多种模型中其脱靶特征极低；同时也表明，广泛使用的商业对照与一个具有临床意义的转录本存在明显互补性，而且即便表现最佳的序列，一旦以间隙体（gapmer）或LNA（锁核酸）修饰寡核苷酸的形式合成，毒性便会重新出现。对于一个长期依靠即兴设计阴性对照的领域而言，这项工作既提供了可用的试剂，也清楚地证明：在一种化学构型和细胞背景下经验证的对照，不能假定在另一种背景下同样安全。
ASO的治疗逻辑十分精妙：12至30个核苷酸组成的单链寡核苷酸通过Watson-Crick配对与互补RNA结合，在间隙体设计中招募RNase H1降解转录本；或者在不进行切割的情况下通过位阻阻断来抑制剪接或翻译。这种简洁性已在神经肌肉疾病（如首个同类产品nusinersen）、神经退行性病变和代谢性疾病中转化为临床成功，并开辟了为携带超罕见突变的个体患者量身定制的"一对一"（N-of-1）治疗新领域，以milasen为代表。
然而，这种同样的简洁性也掩盖了一个持续存在的方法学弱点。由于ASO通过序列特异性杂交发挥作用，观察到的表型在原则上可能反映靶标沉默、转录组其他位置的脱靶杂交，或与序列无关的化学效应，例如硫代磷酸酯骨架与蛋白质的结合，或特定序列基序引发的先天免疫激活。在RNA干扰领域，2000至2010年代曾痛苦地汲取了这一教训：系统性剖析显示，所谓的siRNA"特异性对照"往往本身具有显著的脱靶活性。ASO研究者面临同样的问题，而且由于阴性对照常被实验室和年代反复沿用、不加重新审视，有时甚至被直接带入IND申报研究之中，问题更为复杂。
近期指南已开始推荐使用经过充分表征并事先验证的阴性对照，而非单一乱序序列。以往研究显示，现有阴性对照在不同细胞类型中的表现并不一致，但此类研究仅在一两个细胞类型和单一化学构型中评估了既有序列。据我们所知，此前尚无任何研究将从头、无偏倚的序列设计与多组学验证相结合，并在单一管线下跨越广泛的细胞模型和多种骨架化学构型进行验证。De Bruycker及其同事要填补的正是这一空白。
作者构建了一个计算流程，基于广泛接受的GC含量、熔解温度以及序列免疫刺激效应等标准，生成了6.89亿条随机20核苷酸序列（
图1）。随后依据同源二聚体形成情况、是否存在有利序列基序以及避免与人源和小鼠基因组对齐，将序列缩减为36万条ASO。最终选出14种位阻阻断型对照ASO，以最大程度减少三联体重叠。这些序列与一种广泛使用的商业对照（本文命名为cASO15）以及此前在nusinersen（cASO16）和milasen（cASO17）研发中被描述为阴性对照的两个序列一起进行了基准比较。
针对五种细胞系进行的初始细胞活力筛选淘汰了若干因细胞类型特异性毒性而不合格的候选物：cASO3和cASO6降低了人源细胞的活力，却对小鼠成纤维细胞无明显影响；cASO8和cASO13仅在HEK293T细胞更精细的生长速率分析中才表现出增殖降低。cASO16此前是nusinersen自身临床前的对照，同样在HEK293T细胞中具有毒性——而在原始研究中从未在细胞或小鼠中评估过这一点。头对头剖析显示，cASO16对HEK293T细胞的扰动远大于nusinersen本身，差异表达基因数约为其50倍——这提醒我们，被"继承"下来的"惰性"对照未必真的惰性。随后对幸存候选物进行的RNA测序（RNA-seq）结果显示，其信号收敛于由转染试剂（而非序列本身）引发的胆固醇生物合成特征。三个序列始终产生的差异表达基因和蛋白质数量最少。
将验证扩展至HeLa细胞、小鼠NIH/3T3成纤维细胞、中枢神经系统来源的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞以及人iPSC来源的视网膜类器官后，证实这三个序列在多数但并非全部场景中耐受性良好：其中一个在每种情境下都表现最"干净"，而另外两个则表现出更具模型特异性的转录组扰动，尤其在三维度视网膜类器官中。共聚焦成像确认三者均具有稳健的核内摄取能力，这与位阻阻断型剪接切换活性所需的亚细胞定位一致。引人注目的是，当同样三个序列被重新合成为RNase H活性的间隙体或带LNA翼的位阻阻断剂后，毒性和转录组破坏又重新出现，这表明以某一种化学构型完成的验证无法迁移至另一种构型。
本研究的实用价值十分明确：从事2'-MOE/PS位阻阻断型ASO筛选的实验室现在拥有三种在不同模型中验证过的阴性对照，而不再是一条为单次实验临时拼凑的、未经测试的乱序序列。同样有价值的是方法学贡献：一套无偏倚且可重复的计算机设计流程，其他课题组可据此针对不同物种或模式进行改造。有一项发现尤其值得tau/MAPT研究社区关注：cASO15是一种被作为通用对照销售、并广泛用于多项已发表间隙体研究的对照，结果发现其与MAPT内含子1具有明显的互补性。作者提醒说，文献中已有一项针对MAPT本身的研究可能因这一问题而受到混淆。
不过，应当提及本研究的一些局限性。
验证完全在细胞或视网膜类器官中进行。这些对照在全身、视网膜或鞘内给药后是否仍保持惰性尚未经过检验，因为生物分布、免疫暴露和代谢在体内与培养细胞中存在显著差异。
基于全基因组RNA测序和鸟枪法蛋白质组学的差异表达阈值，可能漏掉对某项研究关注的特定基因而言虽小但有生物学意义的影响——作者本人也承认了这一局限。
化学构型依赖性这一发现虽具科学重要性，但也意味着这三个经验证的序列不能被视作通用空白对照：每引入一种新的骨架或修饰，很可能都需要独立的验证计划，这本身又是一项艰巨任务。
展望未来，这一方法有可能催生出一个由社区共同维护的小型经验证阴性对照参考集，未来或许还可纳入RNase H活性间隙体和siRNA设计、与IND申报毒理学相关物种的数据以及体内耐受性数据，并以参考细胞系或质粒库目前的方式加以分发。将此类通用阴性对照与序列匹配但杂交功能被禁用的比较组配合使用——作者也强调了这一思路——将使研究者能够在同一研究中分离杂交依赖效应与化学依赖效应，从而完善全领域的机制学结论。若该做法被广泛采纳，更优的阴性对照将减少脱靶假阳性判定，增强提交给监管机构的临床前ASO资料包的严谨性，并节省该领域当前耗费于追踪实验设计缺陷所造成的伪像、而非真实生物学现象的时间和资源。
