无需SELEX的适配体从头设计：基于蛋白质结构在数小时内生成DNA/RNA适配体的Xelari流程

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：Aptamers without SELEX: De novo design from protein structure in hours

摘要翻译：基于指数富集配体系统进化（SELEX）的适配体（aptamer）发现可能受靶标可获得性、选择偏倚和优化需求制约。研究人员引入Xelari，一种无需靶标特异性SELEX数据或再训练、可从蛋白质结构进行DNA和RNA适配体从头设计的模块化流程。Xelari将算法模块与在物理或结构参考上训练的代理模型相结合。InNA在483,735个参考对上重现核苷酸-氨基酸相互作用能，均方根误差（RMSE）为0.19 kcal/mol。AliNA在339条来源于PDB的RNA评价序列上取得平均F1为0.757。Edgar与实验折叠能相关，但未重现其绝对尺度，支持其作为排序启发式使用。在报告校准下，ValentiNA在32条回顾性记录（关联27个结构模板）中显示平均绝对误差（MAE）为0.931 kcal/mol、Spearman ρ为0.795；该分析未建立家族独立验证。在前瞻性应用中，针对Treponema pallidum蛋白结构设计的3条DNA适配体在密螺旋体试验中显示细胞相关结合（表观K_D，0.91–2.57 μM）。第4条DNA适配体在针对Tau441的基于血清的杂交适配体-抗体检测中作为捕获试剂。这些应用支持可行性，但未在细胞试验中确立预期靶标结合或总体成功率，将基于结构的设计定位为实验筛选的补充。

研究背景方面，SELEX（指数富集配体系统进化）自1990年以来仍是适配体发现的主要实验方法。适配体具有化学合成、骨架和糖修饰可及、固有免疫原性相对较低、可兼容传统抗体制备困难靶标等特性，但其临床转化并不只取决于高亲和力序列发现。SELEX在发现和优化阶段存在限制：许多蛋白靶标SELEX需制备量、天然构象的纯化靶标，而膜蛋白、瞬态复合物、带翻译后修饰或无序区蛋白难以重组表达或在增溶纯化中保持功能构象；起始文库约10¹⁵条随机序列，覆盖不足10^?9的可能序列空间（40 nt随机区4⁴⁰≈10²⁴）；扩增可引入序列和结构依赖偏倚；选择受缓冲液、离子强度、温度和靶标呈递条件限定；候选转移至其他实验或生理环境后结合性质可改变；选择后引入2′-F、2′-O-Me、硫代磷酸、末端外切酶保护、PEG偶联等修饰可改变构象动力学和结合界面，导致亲和力或特异性损失并需再优化。现有计算策略中，仅序列法依赖一维文献或HT-SELEX数据，难以显式表示三维界面，分布偏移下稳健性有限；结构/物理法需同时解决靶标准备、位点定位、适配体结合构象构建、二级和三级结构预测、折叠与结合自由能评估及化学修饰建模，直接参考计算成本高，且实验解析的适配体-蛋白复合物数量有限并在靶标和适配体家族层面冗余。由此，研究人员将从头适配体设计分解为顺序子问题，对可大规模应用物理参考方法的子任务生成训练数据，并训练专用代理模型以低计算成本近似参考计算，提出Xelari平台。其意义在于减少对靶标特异性适配体数据的依赖，将靶标特异性实验后移，为纯化靶标困难或需快速获得可测候选的场景提供结构优先的设计路径；但当前定位是实验筛选的补充，而非替代。

方法上，Xelari将设计问题分解为九个顺序阶段、八个模块：五个可训练模型（INGA、InNA、AliNA、Edgar、ValentiNA）和三个算法模块（Ehrlich、DiNA、MoNA）。输入为实验或预测蛋白结构（mmCIF/PDB）及适配体长度、可选靶点位点、修饰、离子组成、温度、特异性和亲和力等用户参数；自动完成结构补全与弛豫、表面特异性位点选择、4–6 nt种子片段构建、基于预计算支架库的全长组装、二级结构与折叠能评估、复合物弛豫和亲和力排序。训练/评价参考包括r2SCAN-3c密度泛函理论（DFT）、伞形采样分子动力学（MD）、PDB结构、PatchBag接口集、外部实验折叠能和回顾性纯化亲和记录；前瞻样本为Treponema pallidum脂蛋白Tpp17（PDB: 4U3Q）、Tpp47（PDB: 1O75）、Tp0751（PDB: 5JK2）及Tau441结构模型。流程无需靶标特异性SELEX数据或再训练，模型权重和应用参数在新靶标上固定；单块NVIDIA H200 GPU每靶标约2–3 h，共享GPU设施观察墙钟时间低于24 h，支架库构建离线完成。

研究结果显示如下。Xelari架构：以蛋白三维结构生成亲和力排序的适配体序列及靶标结合复合物模型，输出序列、点括号二级结构、指定修饰和松弛三维模型；九个阶段由八个模块执行，候选生成、过滤、排序和最终选择自动进行，权重在新靶标上不调整。靶标准备：用PDBFixer和Boltz-2补全缺失原子、侧链和大缺口，再用INGA弛豫；Chignolin基准显示INGA促使非目标簇向主导MD簇转变，但原始输出有能量和键长伪影，经GFN-FF与GROMACS 1-ns弛豫后用于下游，结构质量限制后续位点选择和适配体构建可靠性。表面位点特异性分析：在14个非同源抗原的68个表面簇medoid和PatchBag的729个接口对上，Ehrlich对同抗原表面簇的相似度高于异抗原（均值0.88对0.16），同Pfam家族接口相似度更高；Ehrlich可作为构建前局部表面相似性预筛，但分离并非绝对。结合位点定位与种子片段组装：在38个蛋白-适配体共晶结构、19个靶标上，DiNA无锚定定位；11个单参考靶标中10个位于实验位点质心5 ?内，中位距离3.14 ?；靶标级17/19在5 ?内，结构级18/38在5 ?内；多参考靶标因不同适配体占据不同位点而受限，单次运行不能覆盖全部备选位点。InNA成对相互作用评分函数：在483,735个几何、七种氨基酸-核苷酸组合上重现r2SCAN-3c参考能，R²=0.9972、RMSE≈0.19 kcal/mol；LYS和GLU留出子集R²=0.9975、RMSE=0.193 kcal/mol；InNA适合DiNA局部接触评分，不作为全复合物结合自由能直接估计。候选序列二级结构预测：AliNA在339条PDB RNA上平均F1=0.757，ssDNA平均F1=0.810；13条非G4 RNA适配体与实验碱基对中位F1=0.767，作为trRosettaRNA2辅助输入仅轻微改变重构质量；AliNA拓扑输入与下游重构兼容。折叠自由能估计：Edgar内部测试R²=0.958、RMSE=0.91 kcal/mol，外部56条实验记录Pearson r=0.846、Spearman ρ=0.829，但MAE=6.69 kcal/mol、RMSE=8.49 kcal/mol、预测R²=?3.976；Edgar保留折叠稳定性排序但不复现绝对能量尺度，流程不设绝对ΔG_fold接受阈值。支架库生成与结构验证：离线生成约12,000条RNA和11,000条DNA单链支架（15–45 nt）；DNA经RNA重构、naskit转换和MD弛豫后86.3%为B-like、无A-like，RNA 99.5%为A-like；58条ssDNA实验结构重构中位RMSD=2.52 ?、中位lDDT=0.724，35/58的RMSD<3 ?；弛豫可达DNA样骨架，但不证明三级折叠或蛋白结合能量保持，且不枚举G4。从支架库组装全长适配体：500条20–25 nt RNA装配后，嫁接后中位拓扑F1=0.75，41.6%达F1≥0.8，补偿突变后100%达阈值；65.2%候选与MFE参考相差≤1 kcal/mol；嫁接常破坏母体拓扑，补偿突变可恢复操作阈值，但拓扑恢复与能量偏移相关，非独立证据。复合物弛豫与亲和力预测：32条纯化测定记录/27个模板中，ValentiNA校准后Pearson r=0.805、Spearman ρ=0.795、MAE=0.931 kcal/mol、RMSE=1.152 kcal/mol，模板聚合结果相似；在报告校准下呈描述性对应，未建立家族独立预测；三条前瞻T. pallidum预测K_D为1.03、2.18、0.85 μM，与全细胞表观K_D 1.09、2.57、0.91 μM相差1.06–1.18倍，不纳入纯化指标。化学修饰引入：16条修饰记录与16条canonical记录中，修饰组Spearman ρ=0.735、MAE=1.180 kcal/mol，canonical组ρ=0.565、MAE=0.683 kcal/mol；C5、糖和骨架三类比较方向或排序正确但幅度未定量重现；支持定性修饰感知排序，不支持定量ΔΔG或最优修饰位点选择。前瞻性实验验证：模块基准不能证明完整流程产生实验功能序列，故在两种靶标生物学和读出设置中评估完整流程。前瞻性活细胞结合：针对Tpp17、Tpp47、Tp0751设计的DNA适配体在Bruno等报道的全细胞密螺旋体试验中表观K_D为1.09、2.57、0.91 μM；显示细胞相关结合，但未确认对纯化预期靶标的结合或1:1 K_D，且受靶标可达性、膜呈递、局部密度、再结合和非特异表面作用影响。Tau441血清检测前瞻性应用：Tau441结构模型整合序列、翻译后修饰、118条短程交联质谱信息和Tau-抗体复合物信息；指定Ala390附近区域，计算复合物预测适配体结合区约380–400位，但未独立实验定位表位；5′氨基DNA适配体作为捕获试剂用于血清杂交适配体-抗体荧光侧流检测；支持在正交血清格式中的功能部署，不提供适配体单独亲和力或选择性，未实验验证0.92 nM预测K_D，检测灵敏度与特异性不能归因于适配体。

讨论部分总结：Xelari当前贡献不是优于SELEX的亲和力，而是将靶标特异性实验后移；首批候选为微摩尔级，不是亲和成熟适配体。模块化使失败模式可分别检查，但模块回顾性性能不等于端到端准确率；代理模型继承参考标签局限，仿射校准不能恢复参考计算中缺失的物理贡献；化学修饰可支持方向排序但不能定量ΔΔG；G4是当前生成范围边界；结构模型本身构成实验假设的一部分。结论翻译：无需靶标特异性选择即可获得3条结合完整密螺旋体细胞的DNA适配体，第4条Xelari设计DNA适配体在血清中作为Tau441捕获试剂发挥作用。这些研究在两种设置中确立前瞻性实验活性，但未界定该方法总体成功率或第一代设计可被亲和成熟的程度。这些问题需要跨无关靶标的更广泛前瞻测试和对初始候选的系统优化。因此，基于结构的设计应视为实验筛选的补充，而非替代。