《Nucleic Acids Research》：scTHREAD: a cell-resolved long-read transcriptome database with linked isoform, poly(A), junction, and allelic evidence
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细胞分辨的转录本结构对于理解转录本异构体使用、可变多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation, APA）和等位基因表达如何随细胞类型变化至关重要。然而，现有单细胞长读长数据集仍分散于不同研究、平台、物种和工作流程中，阻碍了比较与再利用
细胞分辨的转录本结构对于理解转录本异构体使用、可变多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation, APA）和等位基因表达如何随细胞类型变化至关重要。然而，现有单细胞长读长数据集仍分散于不同研究、平台、物种和工作流程中，阻碍了比较与再利用。在此，研究人员提出scTHREAD（single-cell Transcriptome Hub for Long-Read Evidence, Annotation, and Discovery；https://scthread.ai4sc.ac.cn/），一个用于整合、探索和检索单细胞长读长转录组证据的开放获取数据库。该数据库包含来自34个人类和小鼠数据集的453个测序运行（run），覆盖由Oxford Nanopore Technologies（ONT）和Pacific Biosciences（PacBio）分析的923 389个细胞。一套统一的、平台感知的工作流程编目了12 471 531个run–转录本观测，其中30%携带210 341个不同Ensembl转录本标识符之一。异构体和poly(A)位点使用、剪接连接支持以及等位基因感知计数仍与其来源研究、run、细胞类型和单细胞相链接，确保完整溯源；在覆盖度允许时，差异使用已预先计算。记录可通过网页界面探索，并通过批量下载或文档化应用程序编程接口（application programming interface, API）检索。scTHREAD重现了已知的细胞类型特异性异构体模式，并在三个队列和两种测序技术中识别出单核细胞–T细胞在CCND3、CUTA和PSMB8剪接连接使用上的可重复差异，从而确立其作为在异构体分辨率上研究RNA加工和转录调控的可追溯资源的地位。
论文解读：替代启动子使用、剪接和切割及多聚腺苷酸化扩展了基因的调控与功能输出，产生在组织和细胞状态间系统变化的转录本异构体（isoform）；切割位点选择可改变3′非翻译区并重塑转录后调控。短读长单细胞RNA测序难以跨越远距离转录本特征，限制单细胞异构体重建；长读长测序可在同一读段或分子中捕获延伸外显子链和转录本末端，实现单细胞和群体水平的异构体分辨分析。ONT对天然RNA或cDNA单分子连续测序，PacBio环化共识测序通过多次经过环化模板产生高准确度读段。早期单细胞长读长研究证明千级小脑细胞和单个B细胞的异构体分辨分析可行，错误校正条形码和串联文库设计提高了产量。然而，测序平台、文库方案、读深和转录本重建方法均影响异构体检测与定量。数据分散于GEO、ENA和GSA等通用库，登录结构、文库设计、条形码规范、参考注释和输出格式不同，处理文件很少可直接比较，记录常难回溯至生物来源和处理路径。现有资源沿两个轴分布：是否分辨单细胞、是否分辨转录本结构；bulk长读长资源无细胞身份，短读长单细胞资源无外显子链，isoformAtlas仅覆盖出生后小鼠脑。scTHREAD旨在整合多研究人/鼠单细胞长读长数据，保留研究、run、生物来源、细胞类型和单细胞链接，提供异构体、poly(A)、剪接连接和等位证据层，并通过网页、API和下载检索。该文发表于《Nucleic Acids Research》。
关键技术方法（≤250字）：研究人员从GEO、ENA和GSA收集34项人/鼠单细胞长读长研究的453个run（399个ONT、54个PacBio；923 389个细胞；16种组织、6类生物系统），按条形码或样本/文件分辨准入。所有记录经minimap2、SAMtools和IsoQuant v3.13.1统一处理，人用GRCh38/GENCODE v44、鼠用GRCm39/vM33；液滴10x数据经EPI2ME wf-single-cell/Nextflow，PacBio采用adapter-anchored条形码恢复，Smart-seq2按孔为细胞。poly(A)证据匹配PolyASite 2.0，等位证据用ANCHOR，细胞类型注释和差异使用采用来源内置换检验、Benjamini–Hochberg（BH）错误发现率（FDR）<0.05及效应量阈值。
研究结果：
Database content：通过整合34个数据集、453个run和923 389个细胞，数据库含155个条形码分辨记录和298个样本/文件分辨记录；12 471 531个run–转录本检测中70%为run本地组装结构、30%为参考转录本并覆盖210 341个Ensembl标识符；每层证据可用性独立报告，缺失不同于实测零。人数据为117个记录和736 853个细胞，鼠为336个记录和186 536个细胞，ONT占399个记录。MACF1平台敏感性检查显示21个共享转录本使用分数正相关（Spearman ρ=0.846，名义P=1.32×10
?6），但PacBio仅341个分子类观测；PTPRC模型级敏感性分析显示端点/完整性过滤影响使用分数。由此得出，记录保留溯源，平台和端点过滤会影响模型级使用解释。
Web interface and data access：通过免登录Browse和Search入口、基因页四类证据面板、完整合格转录本分母的使用分数、可过滤的连接坐标/链/基序/支持/跨研究复现，以及CSV/TSV/JSON导出和带OpenAPI模式的API，实现检索；表达显示用每run文库标准化后的log1p(CPM)作描述性展示。由此得出，scTHREAD支持可追溯、可程序化和批量访问。
The reference-absent fraction is large and tracks cell type：通过四项研究17.0亿条分类剪接读段，28.9%端到端匹配注释、18.3%部分匹配、44.6%携带至少一个参考未含结构；未注释剪接位点约为注释位点新组合的四倍。13项完整分类研究中端到端匹配范围为5.5%–45.8%；三骨髓研究15种细胞类型中新颖分数从红系8%至恶性浆细胞80%，六种共享细胞类型跨研究秩一致（Spearman ρ=0.83），各生物系统均>40%，且难以归因于深度；8092个可评估基因中位7种异构体，10 531个基因中位15个支持的poly(A)位点。由此得出，参考缺失普遍且随细胞身份变化，基因级总结会掩盖多结构。
Evidence fields for unannotated structures：通过2 369 193个未注释连接记录，63.7%仅见于单一研究，经典GT–AG比例随复现从49.4%升至97.0%；未注释结构模型较邻近注释转录本更简单，710 535个八项骨髓run模型中位3个外显子/1016 bp，而注释转录本为5个/1603 bp；注释转录本回收减速但未达平台。由此得出，复现、基序、分子支持和来源应分别报告，未注释结构不能直接解释为生物缺失。
Precomputed cell-context annotations and their null calibration：通过两骨髓研究25个run折叠为19个独立study-by-donor/source单元和7个共享谱系，8092个可测基因中2008个获异构体使用注释、10 531个中2558个获poly(A)位点使用注释、6930个中0个获细胞类型差异ASE注释；基因级等位失衡筛查在93个run、18项研究中覆盖37 415个基因并识别9880个。九项全流程负对照无基因通过联合阈值；异构体和poly(A)观测超出对照约一个数量级，ASE接近对照。由此得出，注释经零校准，细胞类型ASE空结果反映该队列规模下功效不足。
Case studies: recovering known evidence and a replicated difference：通过PTPRC/CD45单基因查询，页面给出差异异构体使用（q=0.000879，等效应0.338）、差异poly(A)位点使用（q=0.000601，效应0.204）和无细胞类型等位特异相互作用（q=0.949，效应0.194）；基因全库含8994个连接、2 341 560个带标签分子类观测。外显子3剪接选择在31个run、两项研究465 308条读段中记录，296 997条位于可报告细胞类型；B细胞主要剪入外显子A（91%和74%），单核细胞主要剪入外显子B（52%和51%），跳过三外显子分别为0.4%/7.3%和31%/29%。UMI敏感性重计从312 919条信息读段得114 610个UMI类计数，排除177个冲突键，最大绝对变化2.14个百分点。CCND3、CUTA和PSMB8的单核细胞–T细胞连接使用差异在13供体发现队列、4供体留出队列和独立20供体短读长队列、两种测序技术中均阳性。由此得出，数据库可重现已知谱系模式并识别可重复差异。
讨论部分总结：与相邻资源相比，scTHREAD将多研究单细胞长读长外显子链与细胞及来源分辨的poly(A)位点使用、连接支持、等位感知测量以及研究和run级溯源整合于一个查询界面和API之后；其区分性在于保留来源的粒度，每条记录随研究、run、生物来源和细胞返回，使观测可追踪并在不假定群体或分子单位可互换的前提下组装跨研究集合。局限包括物种、组织、疾病、平台和深度覆盖不均，生物来源注释特异性不一；统一处理不能消除平台、建库或设计偏倚，故将其保留为显式分层。MACF1检查仅为单基因描述性比较，不证明全库平台不变；PTPRC模型级分析显示端点/完整性敏感性；等位层最稀疏且单倍型标签为计算性、无亲本来源；重建模型较参考更短更简单，结构证据按模型报告；差异注释为关联而非机制或因果。PTPRC仅17%–27%读段到达注释3′端，近端读端分析显示50 bp内poly(A)位点支持6.2%–7.7%，背景4.8%，故CD45案例采用组成型外显子3剪接选择；重构异构体计数与读段级CD45剪接计数不可互换。未来将扩展ONT和PacBio研究、代表不足组织及人鼠之外物种，并引入空间长读长和直接RNA测序以连接修饰、异构体、poly(A)、等位和细胞。研究结论翻译：在比较的资源中，scTHREAD独特地将多研究单细胞长读长外显子链与细胞及来源分辨的poly(A)位点使用、连接支持、等位感知测量以及研究和run级溯源整合于一个查询界面和API之后；其区分性在于保留来源的粒度，相关资源在组织、样本、数据集或细胞类型水平汇总，而每条scTHREAD记录随其研究、run、生物来源和细胞返回，使观测可追踪并在不假定群体或分子单位可互换的情况下组装跨研究集合。
