《Biophysica》：Lipid Nanoparticles–Protein Interactions: Biochemical and Biophysical Tools to Unveil the Protein Corona Biointerface and Drive Precision Delivery
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脂质纳米颗粒（LNPs）是临床进展最先进的非病毒核酸递送系统之一；然而，其在生物流体中自发组装的蛋白冠（PC）在很大程度上决定其生物分布，使LNP–PC生物界面成为实现更高效、更选择性递送至非肝器官的关键决定因素。传统终点分析无法解析LNP–PC生物界面的动力
脂质纳米颗粒（LNPs）是临床进展最先进的非病毒核酸递送系统之一；然而，其在生物流体中自发组装的蛋白冠（PC）在很大程度上决定其生物分布，使LNP–PC生物界面成为实现更高效、更选择性递送至非肝器官的关键决定因素。传统终点分析无法解析LNP–PC生物界面的动力学和结构复杂性。本综述系统概述研究该生物界面的方法，涵盖LNP–PC复合物的分离，如差速离心（DC）、密度梯度离心（DGC）、磁分离、光亲和分离、基于抗体的下拉、尺寸排阻色谱（SEC）以及不对称流场流分离（AF4）；PC性质表征，如动态光散射（DLS）、多角度光散射（MALS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、电泳光散射（ELS）、透射电子显微镜（TEM）、核磁共振波谱（NMR）、荧光相关光谱（FCS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）、圆二色光谱（CD）和分析超速离心（AUC）；使用耗散型石英晶体微天平（QCM-D）、表面等离子体共振（SPR）和生物层干涉测量（BLI）实时监测结合动力学；通过等温滴定量热法（ITC）、微量热泳动（MST）和光谱位移（SpS）表征结合亲和力；以及LNPs的高通量筛选方法。整合这些工具可区分硬冠（HC）和软冠（SC）群体，定量测定吸附动力学和结合亲和力，并将PC组成指纹与LNP趋向性相关联。该整合工作流程将LNP–PC生物界面从定义不清的生物层转变为可编程信息界面，为加速下一代LNPs的合理设计提供方法学指南。
1. Introduction
本文指出脂质纳米颗粒（LNPs）是临床进展最快的非病毒核酸递送系统之一，具安全性、可重复给药、大载荷、易工程化和低成本制造等优势，并已从COVID-19 mRNA疫苗拓展至遗传病、感染和肿瘤。然而，肝外高效选择性递送仍是瓶颈。系统注射后LNPs在生物流体中数秒内形成蛋白冠（PC），其硬冠（HC）和软冠（SC）分别由强/慢交换和弱/快交换蛋白构成，并受Vroman效应调控；PC重塑LNP理化性质、生物分布、细胞摄取和免疫识别，主动与被动靶向均需考虑PC。现有体外筛选难以预测体内效能，因此本文整合分离、表征、动力学和高通量筛选方法，旨在将LNP–PC生物界面转化为可编程信息界面。
2. Lipid Nanoparticles and Their Protein Corona: Composition, Endogenous Interference, and Unique Interfacial Features
LNPs由可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和PEG-脂质自组装而成。可电离脂质（40–60 mol%）的pK
a决定电荷响应和ApoE吸附；辅助磷脂（5–15 mol%）和胆固醇（20–40 mol%）调节膜稳定性、流动性和疏水微区；PEG-脂质（1–3 mol%）提供空间稳定，其脱附暴露疏水表面并触发PC。微流控制备影响尺寸、电荷、PEG密度和包封效率。mRNA-LNP、siRNA-LNP和pDNA-LNP因货物和脂质组成不同而具有不同PC；选择性器官靶向（SORT）第五组分可重定向脾/肺，PC组成（ApoE、玻连蛋白（vitronectin）、糖蛋白I等）决定器官特异性。LNP界面是流体、可交换脂质单层，PEG脱附、脂质交换和脂蛋白融合使其区别于无机/聚合物颗粒；内源性脂蛋白和细胞外囊泡（EVs）与LNP密度/尺寸重叠，干扰分离，并可通过膜整合改变LNP身份。cryo-TEM显示ApoE4可部分整合入双层；PC并非独立吸附层而是LNP自身修饰。5A2-SC8与3A5-SC14案例表明，PC组成（ApoE富集与否）决定肝细胞与Kupffer细胞趋向。
3. Methods for Isolation of LNP–PC Complexes
分离方法决定观察HC还是SC。差速离心（DC）高g剥离SC并共沉脂蛋白；密度梯度离心（DGC）较温和但耗时长且密度重叠；磁分离利用SPIONs温和保留复合物但需载铁和配方优化；光亲和分离共价捕获HC/SC并支持绝对定量但需光探针；抗体下拉针对PEG化LNP、高通量但SC损失；尺寸排阻色谱（SEC）低剪切保留部分SC但稀释和柱吸附；不对称流场流分离（AF4）零剪切最接近天然状态但通量和稀释受限。选择应依问题而定。
4. Methods for Characterizing the PC and LNP–PC Complexes
表征需正交。DLS给出流体力学尺寸；MALS联用AF4/SEC给绝对质量；NTA单颗粒尺寸/浓度并估算PC厚度和HC/SC；ELS测ζ电位；TEM/cryo-TEM观察形态和PC厚度；NMR在浑浊介质中提供原子级信息，
19F标记可测PC；FCS单分子扩散；LC-MS是PC组成金标准但破坏空间/动态；CD测二级结构；AUC解析尺寸/密度异质性并区分HC/SC。方法选择应匹配问题。
5. Methods for Characterizing Adsorption Kinetics and Binding Affinity
HC提供持久生物身份，SC快速交换难表征。5.1 QCM-D测质量与耗散，区分HC/SC并实时追踪；样品量大低通量。5.2 ITC无标记测K
D、ΔH、ΔS、ΔG和化学计量N，区分焓/熵驱动；低通量且受聚集干扰。5.3 MST热泳动，荧光标记或内源Trp/Tyr，适合验证结合和区分SC/HC但不适合分离鉴定；SpS双波长发射位移，信噪比好、抗聚集，用于交叉验证。5.4 SPR基于金膜折射率实时测动力学，适合弱瞬态吸附和高通量多重比较。5.5 BLI固定LNP分析血浆PC组成、吸附动力学和受体识别，实时区分SC/HC。六种平台互补。
5.1. Quartz Crystal Microbalance with Dissipation (QCM-D)
QCM-D基于声学传感同时测量质量吸附与耗散变化，可区分刚性HC与高耗散SC，并实时追踪PC交换和结构硬化，适合比较不同LNP配方的结合行为；但样品体积大、制备复杂且通量较低。
5.2. Isothermal Titration Calorimetry (ITC)
ITC以热信号无标记监测蛋白与LNP结合，给出K
D、ΔH、ΔS、ΔG和化学计量N，可区分静电/氢键驱动的焓驱动吸附与疏水效应/水释放驱动的熵驱动吸附；但样品需求较高、通量低，且受LNP聚集和复杂平衡干扰。
5.3. Microscale Thermophoresis (MST) and Spectral Shift (SpS)
MST监测荧光分子沿温度梯度的热泳迁移，可用标记LNP/蛋白或内源Trp/Tyr荧光验证结合强度并区分SC/HC，但不适合分离或鉴定PC。SpS监测双波长发射比值的微小位移，信噪比和抗聚集能力较好，适合与MST交叉验证结合参数，但同样依赖荧光标记且不能用于PC制备性分离。
5.4. Surface Plasmon Resonance (SPR)
SPR基于金属膜附近折射率变化实时监测结合与解离，灵敏度高，适合弱、瞬态蛋白吸附及SC/HC动态组装分析；可固定纳米颗粒并进行高通量多重比较，但需控制固定方式和表面效应。
5.5. Biolayer Interferometry (BLI)
BLI可将LNPs固定于生物传感器，分析人血浆PC组成、吸附动力学及PC组分与细胞受体的结合，实时区分SC与HC，并可用于预测PC介导的LNP行为；其适用样品范围较广，但依赖传感器固定策略。
6. Lipid Nanoparticles High-Throughput Screening Methods
DNA条形码将独特寡核苷酸掺入LNP库，混合体内给药后测序定量器官分布，可发现ApoE非依赖趋向；但共包封可能改变结构，利用3′ UTR条形码可保持单一核酸种类。肽条形码编码于mRNA C端，LC-MS定量，直接反映胞质递送和翻译功能。机器学习（ML）学习LNP性质到PC组成的高维映射，预测关键蛋白吸附并整合多组学，但依赖标准化大数据。
7. Conclusions
工具链覆盖分离、表征、动力学和高通量筛选，但SC捕获、体外到体内转化、计算与实验整合仍存挑战；多技术整合可将PC从障碍转化为功能优势，支持下一代LNPs的理性设计。
