微生物钙化相关基因calcyanin、碳酸酐酶（CA）与脲酶（urease）在生命树中的进化历史：Bacteria、Archaea及真核同源物的比较基因组与结构系统发育研究

《mSystems》：Evolutionary histories of microbial calcification-associated genes across the tree of life

　　

摘要：生物钙化（biocalcification）是动物和藻类形成硬组织和细胞结构的一种广泛过程，在过去541 Ma对全球碳循环发挥了重要作用。多样细菌可形成胞外或胞内碳酸盐，但该过程的遗传基础和进化历史仍认识不足。研究人员在Bacteria和Archaea域对一种胞内钙化标记（calcyanin）和两种具有潜在促进矿化作用的钙化相关基因——碳酸酐酶（CA）和脲酶（urease）——进行了大规模调查。calcyanin的高序列覆盖度同源物限于氧合蓝细菌，并与七个科内的垂直遗传一致，提示其可能起源于Cyanobacteriia纲的共同祖先，尽管部分情况可能反映水平基因转移（HGT）。相反，CA基因广泛分布于所有生命域，系统发育和结构分析支持α、β和γ类的独立起源，随后发生广泛的门间和可能的域间HGT事件。脲酶基因分布广泛，最可能起源于Pseudomonadota或Cyanobacteriota，其系统发育位置符合广泛的细菌和古菌多样化以及细菌对植物和真菌脲酶的可能贡献。总之，这些发现不仅揭示了微生物钙化相关基因的不同进化轨迹，而且提供了基因组框架以生成假设：微生物钙化可能与海洋化学和全球碳循环自太古宙以来发生相互作用。重要性：微生物有助于调节全球碳循环，部分是通过影响地表中碳酸盐矿物形成的时间和地点。然而，与微生物钙化相关的基因尚未在细菌和古菌生命树中广泛评估，也未与早期地球历史联系起来。研究人员分析了一个先前经实验验证的胞内钙化标记和两种在适宜条件下可影响碳酸盐化学的广泛分布酶。结果表明，这些基因系统具有不同且复杂的进化历史，包括谱系内遗传、基因丢失、重复、远缘微生物间转移以及细菌与真核生物间可能的转移。与先前的分类群或基因特异性研究相比，本工作提供了关于促进矿化功能如何起源、多样化并在微生物谱系中扩散的更广泛进化视角。它为研究微生物生理可能如何在地球历史中与海洋化学和碳循环相互作用提供了基因组框架。

研究背景方面，碳酸盐岩是地球重要碳储库，地表CaCO₃池的显著部分由生物介导，但不同生物机制差异明显。真核生物钙化常为生物控制矿化，而许多微生物通过代谢改变局部碳酸盐化学、pH或碱度，诱导胞外碳酸盐沉淀；近期显微学研究又揭示Cyanobacteriota、Pseudomonadota和Nitrospirota等系统发育多样细菌可形成生物调控的胞内碳酸盐包裹体，从而挑战细菌钙化纯属胞外的传统观点。calcyanin由ccyA编码，与蓝细菌和Methylococcaceae胞内碳酸盐相关，但Achromatium和磁小体细菌等缺乏ccyA，提示存在多条分子途径；CA和urease被广泛视为钙化相关酶，可调节CO₂/HCO₃^?转化、碱度生成和局部pH。然而既往研究多聚焦单个分类群或单基因，三者在Bacteria和Archaea域的分布、起源和进化历史未充分解析，限制了对微生物参与早期地球碳循环的评估。基于此，研究人员对calcyanin、CA和urease开展跨生命树的大规模进化研究，并纳入代表性真核CA和urease同源物。研究整合大规模基因组调查、系统发育重建和蛋白结构分析，重建其进化轨迹并探讨生态与地球化学意义；总体结论是三者具有不同进化历史：calcyanin更可能代表与胞内CaCO₃形成相关的早期蓝细菌创新，CA和urease生理功能更广，应谨慎解释为仅在适宜生物和地球化学条件下可促进碳酸盐沉淀的钙化相关酶；其广泛分布和反复HGT表明潜在矿化促进模块多次在细菌和古菌谱系间传播，并可能进入部分真核谱系，但不能直接等同于复杂胞内钙化表型的进化记录。该工作为研究微生物钙化与海洋化学、全球碳循环及早期地球环境相互作用提供了基因组框架。

关键技术方法：以AnnoTree数据库参考基因集和已发表CA序列为起点，针对GTDB R226（143,614种，183个细菌门和21个古菌门）及NCBI基因组进行大规模同源搜索，阈值≥30%序列一致性、≥70%覆盖度和E<1e^?5，并用kofamKOALA复核注释；按KEGG Orthology（KO）和门分层随机抽样；用Clustal Omega和TrimAl比对修剪，IQ-TREE最大似然建树（1,000次超快自举，ModelFinder/BIC选模型），GTDB-Tk提取120个单拷贝标记构建基因组树；用Notung进行重复-丢失（DL） reconciliation；用AlphaFold3预测结构，PyMOL、Foldseek和USalign比较RMSD/TM-score。

结果部分：

calcyanin基因的分布与系统发育。基于GTDB R226大规模搜索，calcyanin同源物保守于Cyanobacteriota门52种，系统发育形成7个明显分支，对应Cyanobacteriia纲内7个科（Nostocaceae、Microcystaceae、Chroococcidiopsidaceae、Thermosynechococcaceae、Gloeomargaritaceae、Neosynechococcaceae和Cyanobiaceae）。与基因组树比较，多数科内成员聚集一致，约90.4%（47/52）同源物支持垂直遗传，可能源自Cyanobacteriia共同祖先；另5个序列与其他科序列聚类，提示HGT。Cyanobacteriota外未检测到≥70%覆盖度同源物，提示其他胞内钙化细菌可能依赖CA等替代机制。

CA在Bacteria和Archaea域中的分布与进化。调查显示CA基因存在于约73.3%细菌种（159门）和约44%古菌种（19门），平均拷贝数2.46±1.54/基因组（n=103,280）；β-和γ-CA几乎保守于所有胞内钙化菌株，α-CA仅见于胞内钙化Pseudomonadota。分层随机抽样序列的最大似然系统发育中，α、β、γ-CA分别形成28、62、61个主要分支，大量序列位于含多个门序列的分支（67.4%、77.9%、47%），提示门间HGT塑造其进化；古菌序列广泛分布于β/γ分支并与细菌姐妹，11个真核CA序列散布于5个α/β/γ分支并与细菌姐妹，结构比较显示CA相关域保守（RMSD≤0.85，TM-score≥0.94），兼容真核CA可能经多次独立HGT来自多样细菌谱系。CA蛋白树与基因组树明显不一致，69.7%同门CA蛋白（n=452）呈多系位置；DL分析平均每物种0.3次CA重复和2次丢失，符合HGT、重复和丢失的复杂历史。跨类CA单树评估中，11,867条序列重建为91个分支，几乎各分支混合α、β、γ及θ/η/δ-CA；分支19中姐妹序列缺乏有意义序列相似性且结构相似性低（TM-score≤0.24，RMSD≥5.71），说明跨类聚类可能为系统发育重建假象。

脲酶（urease）在Bacteria和Archaea域中的分布与进化。以保守催化α亚基为标记，urease α亚基保守于约19.8%细菌种（51门）和约6.7%古菌种（3门），在Pseudomonadota和Cyanobacteriota富集（约40%和60%分类阶元）；2,854种含2–6拷贝，主要属于Pseudomonadota和Actinomycetota，其余多为单拷贝。2,246条代表序列解析为27个主要分支，除3个古菌分支外，其余以Pseudomonadota为主并含多样细菌门；27个分支α亚基结构高度保守（TM-score≥0.93，RMSD≤1.39），提示urease基因主要经门间HGT在多样细菌和古菌谱系传播，Pseudomonadota为主要但非唯一供体。植物和真菌urease在主要由Pseudomonadota、Bacteroidota和Cyanobacteriota细菌序列组成的分支内形成姐妹谱系；真核urease的UreA和UreB域与细菌α和β亚基高结构相似（TM-score≥0.84，RMSD≤1.63），兼容细菌对植物和真菌urease祖先的可能贡献。urease α亚基基因树与基因组树高度不一致，98.3%同门蛋白（n=235）呈多系；DL分析平均每物种0.54次重复和5.81次丢失，提示广泛进化周转。来自Lactobacillus fermentum、Lactobacillus reuteri和Arthrobacter mobilis的3个实验表征酸脲酶（最适pH 2–4.5）位于两个也含中性脲酶（最适pH 6–8.2）的分支，提示耐酸性可能不止一次进化，但多数邻近同源物pH未测，需生化表征。

讨论部分总结：原文提出calcyanin在氧合蓝细菌7科中以垂直遗传为主，提示胞内钙化性状可追溯至Cyanobacteriia共同祖先。CA方面，主要类最符合独立起源；反复门间HGT连同重复和丢失显著贡献现分布；许多古菌CA与细菌姐妹兼容可能域间转移，但古旁系同源、差异基因丢失、采样不全和分辨率有限仍为替代解释；部分真核CA位置兼容细菌到真核获得，但应视为候选转移场景而非确定HGT。CA广泛多功，不宜作为跨类群碳酸盐生物矿化表型起源的单独代理。urease方面，其广泛保守并富集于Pseudomonadota和Cyanobacteriota；门间HGT可能是多样化主要驱动，Pseudomonadota可能是关键传播枢纽；三维结构高度保守；植物和真菌urease在细菌主导分支内姐妹，结构模块与细菌α/β亚基相关；酸脲酶分属两分支提示酸耐受可能多次进化，但需生化验证。urease最可能起源于Pseudomonadota或Cyanobacteriota共同祖先，经Pseudomonadota参与HGT传播，并可能贡献植物和真菌urease祖先；古代共享祖先、差异丢失和深部关系未解仍为替代解释。地球环境方面，urease产氨提高碱度可能影响海水化学；钙化细菌群起源约3.6–2.6 Ga，与地表化学变化时间重叠不证明共进化，而提供假设框架；早期高CO₂海洋酸化可能选择耗H⁺或产OH^?机制；太古宙中期CO₂下降和碳酸盐积累与微生物多样化重合，但这些联系是待检验假设。方法上，该框架结合AnnoTree、广泛同源筛选、直系同源验证、分层采样、系统发育和基因树/物种树比较，AlphaFold3、Foldseek和USalign提供结构证据；局限是分层随机抽样不能完全消除采样不确定性，系统发育不一致不能单独区分HGT与古旁系同源、差异基因丢失、分类群采样不全或分辨率有限，因此HGT和重复-丢失模式应解释为总体趋势而非精确事件重建。

研究结论（Conclusions）翻译：整合系统发育和结构分析揭示，微生物钙化相关基因具有不同进化历史。calcyanin似乎代表与胞内CaCO₃形成相关的早期蓝细菌创新；CA和urease具有更广泛生理作用，应更谨慎地解释为仅在适宜生物和地球化学条件下可促进碳酸盐沉淀的钙化相关酶。CA和urease的广泛分布和反复水平转移表明，潜在促进矿化的功能模块已在细菌和古菌谱系间反复传播，并可能进入部分真核谱系，但这些模式不应被解释为复杂胞内钙化表型进化的直接记录。研究人员注意到，域间和细菌到真核转移证据主要基于系统发育位置、结构相似性和基因树/物种树不一致；这些模式虽有提示性，但不足以完全解决转移方向、时间和机制。未来结合基因结构、内含子分布、亚细胞靶向信号、共线性、基因组邻域及主要谱系更广泛直系同源采样的分析，将有助于更严格检验这些场景。更重要的是，碳酸盐生物矿化可能是依赖协同基因模块的复杂表型，而非单个标记基因或酶；例如Bacillus subtilis中五基因lcfA操纵子经实验涉及CaCO₃沉淀，磁小体细菌（MTB）中保守磁小体基因簇控制磁小体膜形成、铁转运、晶体生物矿化和链组装等连续步骤。未来比较经实验验证钙化生物中calcyanin、CA、urease及其他候选基因周围的基因共线性和基因组邻域，可能揭示与碳酸盐生物矿化相关的保守多基因模块。其他古老酶家族亦显示类似进化复杂性，如氨酰-tRNA合成酶在Bacteria、Archaea和Eukarya中广泛HGT、基因置换和谱系特异性丢失，谷氨酰胺合成酶研究显示表观系统发育混合可源于侧向转移和古代基因重复后的差异保留或丢失；因此CA和urease观察到的模式与其他古老酶家族的网状进化历史总体一致，同时强调不能孤立地将基因树不一致解释为HGT证据。更广泛地，该工作流程支持采用包容但受控的门间同源物发现策略，即先以≥30%一致性、≥70%覆盖度和E<1e^?5检索候选序列，再经直系同源/功能注释和系统发育验证。除重建基因历史外，研究结果与以下可能性一致：微生物碳酸盐形成能力可能影响并响应早期海洋化学和大气CO₂水平变化；然而这些联系仍是基于基因组模式提出的更广泛地球生物学假设，而非当前数据的直接结论。该进化框架为未来检验微生物生理、碳酸盐矿物形成和地表环境在地质时间中如何相互作用提供了基础。