可可根际促生菌（PGPR）对苗圃条件下土壤性质与可可幼苗发育的影响——以哥伦比亚西博亚卡地区为例

《Cogent Food & Agriculture》：Native plant growth-promoting rhizobacteria influence selected soil properties and cocoa seedling development under nursery conditions in Western Boyacá, Colombia

　　

生物接种剂的开发需要多学科专业知识以确保其在田间条件下的可靠性。本研究评估了从可可根际分离的四种原生根际细菌菌株，旨在将其纳入生物肥料微生物群落，并评估其对苗圃条件下（位于哥伦比亚博亚卡省保纳市）土壤酶活性、理化性质及形态指标的影响。研究比较了七种处理：两种原生菌群（单次施用和多次施用）、一种商业接种剂、一种化学肥料以及一个未接种对照，采用完全随机设计，每组处理设置五个重复区组，每区组包含20株植物。每种处理在试验开始和6个月时分别采集三个混合土壤样品进行分析。原生菌群由解磷沙雷氏菌属（Serratia spp.）和促生假单胞菌属（Pseudomonas spp.）组成，而商业接种剂含有褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）和荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）。分子鉴定显示所选菌株间存在较高的功能冗余性，且在解磷、定殖和促生方面具有较强潜力，这与它们重叠的生态位一致。生物接种剂略微提高了纤维素酶活性、有机碳、总氮和有机质含量，而化学施肥则增加了有效磷和交换性镁的含量，同时降低了pH值。仅硼（B）、pH值、磷（P）和镁（Mg）在不同处理间表现出显著差异（p < 0.05）。多变量分析表明，生物接种剂与较高的酶活性和有机质变异性相关，而化肥则与更高的碳氮比（C/N）和磷含量相关。形态指标未受显著影响，表明处理对底物的特定效应有利于植物生长，但仍需田间规模的验证。本研究的局限性包括仅在苗圃条件下进行、评估期为六个月，以及缺乏田间/生物安全性验证。

研究背景与目的

可可（Theobroma cacao）是全球热带地区重要的经济作物，尤其在拉丁美洲、非洲和亚洲，支撑着约1400万生产者的生计。在哥伦比亚，可可种植不仅关乎巧克力产业，还涉及化妆品和制药领域，具有重要的社会经济价值。然而，哥伦比亚可可产量长期偏低（400–560 kg/ha），且传统上依赖低化肥投入的策略虽有助于维持可持续性，却限制了产量的提升。与此同时，气候变化加剧了病虫害问题，进一步威胁了可可生产。

为解决上述问题，研究者们开始关注有益微生物的应用，特别是生物肥料和生物刺激素，它们能够通过直接和间接机制改善土壤肥力并促进植物生长。相较于单一菌株接种，由多种菌株组成的微生物群落往往能提供更广泛的益处。基于此，本研究旨在：（1）在基因组水平上表征从哥伦比亚西博亚卡地区可可根际筛选出的四株原生促生菌（PGPR）；（2）评估两种原生微生物群落、一种商业接种剂和一种化学肥料对苗圃条件下可可幼苗土壤理化性质、酶活性及形态指标的影响。研究假设认为，结合促生和解磷功能的原生根际细菌群落能够改善底物化学条件并增强土壤微生物活性。

研究方法与技术路线

研究人员从哥伦比亚博亚卡省保纳市和科佩尔市的可可产区采集土壤样品，从中分离并筛选出四株具有促生潜力的根际细菌。关键技术方法包括：

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  菌株筛选与生化鉴定：采用Ashby琼脂、Pikovskaya培养基和NBRIP培养基进行选择性分离；通过Nessler法和Salkowski法检测铵（NH₄⁺）和吲哚-3-乙酸（IAA）产量；利用PVK、SIM、尿素肉汤、TSI、DNase琼脂和西蒙斯柠檬酸盐等生化试验进行初步鉴定。
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  基因组测序与分析：使用DNeasy PowerSoil^TM QIAGEN试剂盒提取DNA，在Illumina^? NovaSeq^TM 6000平台进行双端测序（2×150 bp）。序列经质量控制后，使用SPAdes v3.15.5进行de novo组装，并通过Quast v5.2.0和Checkm v1.2.3评估组装质量。功能注释借助Prokka v1.14.6、RAST-tk v1.073和PATRIC完成，同时利用Kofamscan v1.3.0（KEGG数据库）和PGPg_finder v1.1.0（PLaBAse数据库）分析促生潜力。分类学鉴定采用GTDB-tk v2.4.0，ANI计算使用Pyani v0.3.0，系统发育树构建使用Phylophlan v3.1.68。
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  苗圃试验：采用完全随机设计，设置7个处理（含阴性对照），每处理5个重复，每重复20株植物，共700株。使用IMC 67可可品种，底物为土壤、有机肥、白云石石灰和稻壳的混合物（65:25:15:4 w/w）。在试验开始和6个月时测定土壤理化性质和酶活性（3个混合样品/处理），每月测量形态指标（高度、分枝数、叶片数）。
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  统计分析：数据经正态性和方差齐性检验后，采用单因素方差分析（ANOVA）或Kruskal-Wallis检验，并结合Tukey HSD或Dunn事后检验进行多重比较（显著性阈值0.05或0.10）。主成分分析（PCA）用于探索处理与土壤变量之间的关系。

研究结果

1. 菌株的IAA、NH₄⁺产量及萌发促生潜力

菌株AM1DD3R3-6A表现出最高的铵产量（4451.81 μM）和IAA产量（69.1 μg/mL），并在萌发试验中促进了最大的根系生长（3.53 cm）。AM2D1R2-4C和AM1D2R2-4的表现也优于商业对照（Nitrofix，A. brasilense），尽管差异不显著，表明这些细菌具有促生潜力。

2. 四株分离菌的基因组分析

通过CheckM和QUAST分析，三株分离菌（AM1D2R2-4、AM1DD3R3-6A和AM2D1R2-4C）被归入假单胞菌属（Pseudomonas）。GTDB-tk将所有这些菌株鉴定为同一物种——副肉假单胞菌（Pseudomonas paracarnis）。ANI计算和系统发育树（涵盖354个基因组）进一步证实，这些菌株与P. carnis亲缘关系最近，且AM1DD3R3-6A在系统发育上与另两株存在差异。功能注释显示，Pseudomonas paracarnis菌株富集了与铵同化、磷酸盐溶解（通过有机酸代谢）、硫同化、铁载体介导的铁获取等相关的基因。沙雷氏菌属（Serratia nevei）菌株也显示出类似的遗传特征，两者均具有较强的提高养分可利用性的能力。此外，两属菌株均携带重金属（如锌、铜、镍）代谢和异源化合物降解相关的基因，以及植物激素（如IAA、细胞分裂素、多胺）和维生素合成的基因。KEGG通路重建表明，Pseudomonas菌株主要通过硝酸盐同化产生铵，而Serratia和Pseudomonas均具有通过碱性磷酸酶溶解磷酸盐的潜力。

3. 处理对形态指标的影响

不同处理在分枝数、叶片数和株高上均未产生统计学显著差异（分枝数：p=0.784；叶片数：p=0.400；高度：p=0.540）。所有处理的均值范围相近（分枝数1.46–1.56，叶片数5.56–5.79，高度16.98–17.94 cm），表明在试验条件下，各处理未能显著改变幼苗的初期营养生长。

4. 促生微生物对苗圃土壤条件的影响

经过6个月的生长，多数土壤参数呈下降趋势，但某些变量受处理影响。在众多理化及酶学参数中，仅硼（B）（p=0.026）、pH（p=0.044）、交换性镁（p<0.001）和有效磷（p=0.038）在处理间表现出统计显著差异。化学施肥（T6）显著提高了有效磷和交换性镁含量，并降低了pH值。生物接种处理（T1-T5）则导致硼含量下降（尤其是T3）。此外，微生物群落处理使纤维素酶活性、总有机碳、总氮和有机质略有增加。

5. 生物与化学肥料作用下土壤组分间的交互作用

主成分分析（PCA）显示，生物处理（T1-T5）样品聚集于右下象限，与纤维素酶活性、有机质含量和pH值等高变异参数相关；化学处理（T6）样品位于左下象限，受碳氮比（C/N）、有效磷、吸湿水和电导率（EC）驱动；对照组（T0）位于右上象限。PC1解释了27.82%的变异，区分了化学处理与其他处理；PC2解释了20.69%的变异，主要关联硝态氮和铵态氮，表明这些养分在土壤中的更高可利用性。

讨论与结论总结

讨论要点：研究人员指出，从可可根际筛选出的四株细菌中，三株被鉴定为Pseudomonas paracarnis，一株为Serratia nevei。这些菌株表现出高产IAA和铵的能力，以及促进种子萌发的潜力，优于此前报道的同类菌株。基因组分析揭示了它们在生物施肥（如解磷、产铁载体）、生物修复（如重金属抗性）和植物激素合成方面的丰富遗传潜能。然而，研究也强调，基因组功能预测并不等同于实际表达活性，功能冗余现象需要通过实验进一步验证。讨论中还提到，化学肥料显著改变了土壤pH和养分有效性，而微生物处理则倾向于稳定pH并增强有机质动态和酶活性。对于形态指标无显著差异的结果，研究人员认为这可能与试验周期较短（6个月）有关，并引用了其他研究中在更长周期（12–22个月）观察到显著促生效应的案例。

研究结论翻译：生物肥料不仅与提高农业生产力相关，而且对于维持和改善土壤肥力与健康至关重要。尽管在栽培初期，生物或化学肥料的使用并未提供支持其应用的形态学证据，但在苗圃条件下，微生物群落对土壤参数产生了可测量的影响，包括有机质含量增加、纤维素酶活性增强以及土壤pH值的稳定，而常规施肥（T6）则显著提高了有效磷和交换性镁。然而，脲酶活性、总氮（TN）、溶解性有机氮（DON）、铵态氮（NH₄⁺-N）和硝态氮（NO₃^--N）等参数在各处理间保持稳定，这表明在六个月的评估期内，微生物接种或化学施肥均未显著影响氮矿化或脲酶活性。总体而言，本研究揭示了微生物与化学输入之间的明显区别：微生物接种剂主要增强生物活性（如纤维素酶活性、有机质动态和pH调节），而化学施肥主要提高养分有效性。重要的是，微生物接种剂通过多种机制发挥作用，其对土壤功能的长期影响可能需要更长时间才能在这些参数上产生可测量的效果。本研究鉴定了一组与保纳地区可可种植相关的原生根际细菌（Pseudomonas paracarnis和Serratia nevei），这些菌株展现了促进植物生长的能力，尤其是在种子萌发和根际定殖方面，并增强了营养改善（如解磷、IAA产生）等功能。其展示的基因组和功能潜力使其成为开发针对可可农业的生物接种剂的有前景候选菌株。然而，未来需要在田间尺度上进行验证，以确认其在多样化农业生态条件下的农艺和经济表现。