基于噬菌体展示与分子对接的玉米赤霉烯酮检测肽基生物测定法开发

《Food and Agricultural Immunology》：Development of a peptide-based bioassay for zearalenone detection via phage display and in silico analysis

　　

玉米赤霉烯酮（ZEN）是一种普遍存在的真菌毒素，对食品和饲料安全构成威胁，因此需要快速且可靠的检测方法。研究人员从12聚体噬菌体展示文库中分离出一种ZEN结合肽，并通过分子对接、合成、高效液相色谱（HPLC）纯化以及基于链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）的酶联免疫吸附测定（ELISA）对其进行了表征。研究人员评估了其特异性、储存稳定性及实际谷物样品的加标回收率。预测的肽G-W-H-V-H-S-H-R-F-A-S-I与ZEN之间的结合自由能为?4.95?kcal/mol。该生物素化探针的纯度达到98.77%，检测ZEN的检出限（LOD）约为5?ng/mL。与其他真菌毒素及ZEN类似物的交叉反应率低于10%。在混合真菌毒素体系与单一ZEN真菌毒素体系之间，检测响应高度一致。该探针在4°C和25°C条件下可稳定保存28天。在加标谷物中的回收率为87.43%–108.10%，在标准参考物质中的回收率为80.0%–89.5%。该肽为ZEN检测及未来生物测定应用提供了一种稳定、易于合成的识别元件。

玉米赤霉烯酮（ZEN）作为一种由多种镰刀菌属（*Fusarium*）产生的非甾体类雌激素真菌毒素，广泛污染玉米、小麦和大麦等农产品，并通过食品链导致人类不可避免的暴露。慢性暴露于ZEN可引发生殖毒性、免疫毒性和遗传毒性等毒理学效应，其机制主要涉及与雌激素受体的竞争性结合。鉴于ZEN对人和动物的严重健康风险及其在储存加工过程中的稳定性，全球监管机构已设定严格的最大残留限量，因此亟需灵敏、快速且经济的监测方法。传统仪器分析法如高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）虽准确可靠，但耗时、昂贵且需复杂样品前处理，难以满足现场和高通量筛查需求。免疫学方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）虽灵敏度高、操作简单，但其核心识别元件——单克隆或多克隆抗体——生产成本高、周期长，且存在批间差异和稳定性有限等问题。因此，开发可替代抗体且在成本、稳定性和规模化生产方面具有优势的新型识别分子成为重要研究方向。肽类分子，特别是通过组合文库筛选技术（如噬菌体展示）鉴定的肽，具有尺寸小、稳定性高、易于化学合成和修饰、生产成本低等突出优点。本研究将噬菌体展示技术与分子对接等计算手段相结合，旨在开发一种新型ZEN检测肽探针，为未来生物传感器构建奠定基础。

研究人员利用Ph.D.-12?噬菌体展示肽库（多样性约2.7×10⁹独立克隆）对固定化ZEN进行了三轮亲和生物淘选，富集获得特异性结合克隆；通过间接ELISA鉴定阳性克隆并进行DNA测序；利用AutoDock Tools（v1.5.6）对候选肽与ZEN进行分子对接模拟，以结合自由能和相互作用力为依据筛选最优肽序列；采用Fmoc固相肽合成（SPPS）法合成含柔性连接序列和生物素标签的肽探针，经反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，电喷雾电离质谱（ESI-MS）鉴定分子量；最后通过链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）放大系统的ELISA评估探针的分析性能，包括灵敏度、特异性、交叉反应率、稳定性，并在加标玉米样品和四种具有认证参考值的谷物样品（大豆、玉米、小麦、燕麦）中验证实际应用能力。

### 富集ZEN结合噬菌体通过生物淘选实现

经过三轮针对固定化ZEN的生物淘选，结合噬菌体的回收率从第一轮的4.66×10^?2%增加至第三轮的2.7%，实现了58倍富集。随着Tween-20浓度从0.1%增至0.5%，并使用游离ZEN进行竞争性洗脱，筛选策略有效富集了特异性识别ZEN的噬菌体克隆。

### ZEN结合克隆的鉴定与测序

第三轮淘选后随机选取20个单个噬菌体克隆进行ELISA评估，其中7个克隆（C3、C5、C6、C8、C11、C17、C19）表现出显著高于阴性对照的OD₄₅₀值（≥0.4），另有4个克隆显示中等结合信号（≥0.2）。对16个克隆的ssDNA测序分析获得8条独特肽序列，其中序列G-W-H-V-H-S-H-R-F-A-S-I（命名为肽5）出现7次，且全部对应强ZEN结合克隆，表明该序列为文库筛选中收敛选择出的最优ZEN结合基序。

### 肽-ZEN相互作用的分子对接分析

对肽5、肽4和肽6进行分子对接模拟，肽5表现出最低预测结合自由能?4.95 kcal/mol（平均预测值?4.76 kcal/mol），热力学上最有利。LigPlot分析显示，肽5与ZEN之间形成一条特异性氢键（PHE9残基，供体-受体距离3.33 ?），同时HIS7残基参与疏水接触，共同稳定复合物。肽5含有5个芳香族残基和7个氢键供体，其组成提供了丰富的残基级理化相互作用，解释了其优异的实验结合信号。

### 肽探针的合成与表征

综合噬菌体展示筛选、ELISA验证和分子对接结果，选择肽5作为先导候选物。在C端添加柔性连接序列（G-G-G-G-S）和生物素化赖氨酸后，最终探针序列为G-W-H-V-H-S-H-R-F-A-S-I-G-G-G-G-S-K(Biotin)-NH₂。经RP-HPLC纯化，主峰保留时间9.08 min，纯度达98.77%。ESI-MS谱图显示m/z 701.84和1052.36两个主要峰，分别对应[M+3H]³⁺和[M+2H]²⁺电荷态，计算分子量为2102.39 Da，与理论值2103.34 Da高度一致。生物素化探针与非生物素化对照肽的ELISA信号相当，表明C端生物素标签对结合域无空间干扰。

### 生物素化肽探针的分析性能

通过SA-HRP放大系统评估探针性能，确定最佳探针工作浓度为60 μg/mL。在5–100 ng/mL范围内，标准曲线呈良好线性关系，线性回归方程为y = 0.0189x + 0.1046，相关系数R² = 0.9986，重复测量变异系数（CV）为0.15%–4.99%，检出限（LOD）约为5 ng/mL。特异性实验表明，探针对AFB1、OTA、DON、FMN和T-2毒素等非靶标真菌毒素在20–120 ng/mL浓度范围内均无显著结合。在混合真菌毒素体系中（含AFB1、DON、OTA、T-2毒素和FMN共50 ng/mL），探针对10–50 ng/mL ZEN的检测响应与单一ZEN体系高度一致，表明其具有良好的抗干扰能力。对ZEN结构类似物（α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉烷醇、β-玉米赤霉烷醇）的交叉反应率均低于10%。储存稳定性实验显示，探针在4°C和25°C条件下储存28天保持高度稳定的结合活性，37°C条件下虽有信号逐渐下降但仍保留显著活性，表现出良好的热稳定性。

### 在实际谷物样品中的应用

在玉米样品提取液中加标ZEN（浓度10、15、20、25、30 ng/mL）进行回收率实验，平均回收率分别为87.43%、96.33%、108.10%、105.27%和106.66%，均在80%–120%的回收率要求范围内。对四种具有认证参考值的谷物样品（大豆、玉米、小麦、燕麦）进行检测，检测浓度与认证值紧密吻合，回收率分别为88.7%、89.5%、89.2%和80.0%，标准偏差范围为1.04–2.29 μg/kg，证明该肽探针可在真实复杂食品基质中以可接受的准确度和精密度有效应用。

讨论部分总结了本研究的核心成果：通过噬菌体展示与计算验证相结合的策略成功开发了新型肽识别探针，58倍富集因子证实了筛选方案的有效性。肽5的氨基酸组成揭示了结合机制的结构基础——组氨酸残基提供氢键和金属配位潜力，色氨酸和苯丙氨酸等芳香族残基可与ZEN的芳香结构发生π-π堆积作用，疏水残基（V、A、I）有助于形成与ZEN亲脂性相匹配的疏水结合口袋。与单克隆抗体相比，合成肽探针具有化学合成快速重现（无需动物免疫和杂交瘤开发）、稳定性更高（尤其在高温、极端pH或有机溶剂条件下）、易于化学修饰偶联以及小尺寸（1–5 kDa vs 抗体150 kDa）等优势。

研究结论：本研究通过噬菌体展示筛选与分子对接分析相结合的方法，成功鉴定并表征了一种对玉米赤霉烯酮（ZEN）具有结合活性和特异性的新型12聚体肽（G-W-H-V-H-S-H-R-F-A-S-I）。合成的生物素化肽探针纯度高（98.77%），分子身份经质谱确认。该肽探针在ZEN检测方面有望成为传统抗体的经济高效替代方案，在生产速度、稳定性和易于修饰方面具有优势。本研究结果为开发稳健、灵敏、可现场部署的基于肽的真菌毒素生物测定法和未来生物传感器平台奠定了坚实基础。