《Nucleic Acids Research》：CPSF6 maintains genomic stability by stabilizing RAD52 and promoting CHK1 activation
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RAD52和CHK1是DNA损伤应答（DNA damage response, DDR）中的关键因子，发挥多重功能，包括参与转录-复制冲突（transcription–replication conflicts, TRCs）的解除。然而，它
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RAD52和CHK1是DNA损伤应答（DNA damage response, DDR）中的关键因子，发挥多重功能，包括参与转录-复制冲突（transcription–replication conflicts, TRCs）的解除。然而，它们的功能如何被调控仍未完全阐明。在此，研究人员揭示切割和聚腺苷酸化特异性因子亚基6（cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 6, CPSF6）是一个此前未知的DDR因子，能够增强RAD52的稳定性并促进CHK1的激活。具体而言，CPSF6竞争性地与RAD52相互作用，从而阻止RAD52与E3泛素连接酶UHRF1结合及随后的蛋白酶体降解。此外，CPSF6增强ATR–CHK1相互作用以促进CHK1激活，进而促进下游CHK1–PLK1–RAD51通路的激活。CPSF6在稳定RAD52和促进CHK1激活方面的双重功能有助于其在TRC解除中的作用。CPSF6缺失导致R-loop积累和转录相关DNA损伤。值得注意的是，CPSF6在DDR中的这些作用独立于其在pre-mRNA 3′-端加工中的经典功能。综上，研究人员的发现确立了CPSF6作为维持基因组稳定性的关键新型因子，其中TRC的解除是一个重要机制。
# 论文解读文章
## 一、研究背景与科学问题
细胞持续遭受由细胞代谢产物和环境因素引起的DNA损伤。为维持基因组稳定性，细胞进化出精细的调控网络——DNA损伤应答（DNA damage response, DDR），以检测、信号传导和修复DNA损伤，并协调细胞命运决定。DNA双链断裂（double-strand breaks, DSBs）是最具危害性的损伤形式，其修复主要依赖同源重组（homologous recombination, HR）和经典非同源末端连接（classical non-homologous end joining, c-NHEJ）两条通路。在HR过程中，RAD51重组酶取代单链DNA结合蛋白RPA形成核蛋白丝是关键步骤，而RAD52和BRCA2是RAD51–RPA交换的关键介导因子。
尽管人类RAD52长期以来被认为仅在单链退火（single-strand annealing, SSA）途径中作为备份修复机制，但近年研究揭示RAD52是基因组稳定性的多功能守护者，参与合成依赖性链退火、断裂诱导复制、端粒选择性延长、复制叉逆转、BRCA缺陷合成致死以及转录-复制冲突（transcription–replication conflicts, TRCs）等多种过程。然而，关于RAD52蛋白水平如何被调控，尤其是其翻译后修饰和降解机制，此前几乎未知。
另一方面，除了BRCA2通路外，TOPBP1–ATR–CHK1通路是促进RAD51招募和激活的另一条关键途径。CHK1在DNA损伤后被ATR磷酸化激活，进而磷酸化PLK1以促进RAD51在损伤位点的聚集。然而，调控ATR–CHK1相互作用的机制仍有待进一步阐明。切割和聚腺苷酸化特异性因子亚基6（cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 6, CPSF6）已知是切割因子Im（cleavage factor Im, CFIm）复合物的组分，在pre-mRNA 3′-端切割和聚腺苷酸化中发挥作用，并依赖其C端富含精氨酸区域介导相分离。本研究旨在揭示CPSF6作为DDR因子的未知功能及其分子机制。
## 二、研究内容与主要结论概述
研究人员通过基于BioGRID数据库的DDR候选因子筛选，结合激光微照射技术鉴定出CPSF6可被招募至DNA损伤位点，且这一招募依赖于聚ADP核糖化（PARylation）和RNA识别基序（RNA recognition motif, RRM）。功能实验表明，CPSF6缺失导致微核形成增加、细胞对多种DNA损伤药物敏感性增强，并损害HR和SSA修复。机制上，CPSF6通过竞争性结合RAD52，阻止E3泛素连接酶UHRF1介导的RAD52 K48连接泛素化和蛋白酶体降解。同时，CPSF6作为介导因子，直接与ATR和CHK1的C端调控结构域相互作用，促进ATR–CHK1结合和CHK1磷酸化，进而激活CHK1–PLK1–RAD51通路以促进RAD51招募和RAD51–RPA交换。CPSF6的这两种功能共同促进TRC的解除。CPSF6缺失导致R-loop积累、染色质桥形成和早期S期γH2AX灶增加，这些均依赖于转录活性。重要的是，CPSF6在DDR中的功能独立于其经典的前体mRNA加工功能及相分离能力。该研究发表在《Nucleic Acids Research》。
## 三、主要关键技术方法
本研究使用的主要技术方法包括：基于BioGRID数据库和激光微照射的DDR候选因子筛选；CRISPR–Cas9基因敲除构建CPSF6敲除细胞系；免疫沉淀联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定RAD52相互作用蛋白；体外pull-down和竞争性结合实验验证蛋白间直接相互作用；HR、NHEJ、MMEJ和SSA报告系统检测DSB修复效率；免疫荧光染色检测R-loop（S9.6抗体）、γH2AX、RAD51、RPA等损伤灶；泛素化检测采用变性免疫沉淀；染色质桥分析评估基因组不稳定性。所用细胞系为人骨肉瘤U2OS、人胚肾293T、HeLa及乳腺癌MDA-MB-231、HCC1937、SUM149PT等，均来源于美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。
## 四、研究结果
### CPSF6 is a candidate involved in the DDR
研究人员以15个经典DSB修复蛋白作为参照，从BioGRID数据库检索相互作用蛋白并进行排序，筛选出16个未见报道且未收录于Reactome数据库的候选因子。通过激光微照射实验，仅CPSF6在损伤位点表现出明显招募，在约3分钟时达到峰值，提示CPSF6可能参与DDR。
### CPSF6 is involved in the DDR
PARP抑制剂ABT-888而非ATM抑制剂KU-55933可阻断CPSF6在损伤位点的募集，表明PAR化修饰调控该过程。RRM结构域缺失突变体丧失募集能力，且CPSF6可直接结合聚ADP核糖（poly(ADP-ribose), PAR）链。CPSF6缺失增加ETO诱导的微核形成，并增强对ETO、表柔比星、喜树碱和羟基脲的药物敏感性。报告系统实验表明，CPSF6缺失损害HR和SSA修复，但不影响NHEJ和MMEJ。值得注意的是，CPSF5或CPSF7缺失并不降低HR效率，表明CPSF6在HR中的作用具有特异性。
### CPSF6 protects RAD52 from proteasomal degradation
CPSF6缺失在多种细胞系中一致降低RAD52蛋白水平但不影响其mRNA水平，且可被外源CPSF6回补所逆转。放线菌酮追踪实验显示CPSF6缺失加速RAD52蛋白降解。E1抑制剂MLN7243和蛋白酶体抑制剂MG132均可逆转CPSF6缺失引起的RAD52减少，而自噬抑制剂氯喹无此作用。CPSF6缺失增加RAD52的K48连接泛素化水平，证实CPSF6通过泛素-蛋白酶体系统保护RAD52。
### CPSF6 interacts with RAD52 to prevent its ubiquitination by UHRF1
通过免疫沉淀-质谱分析，研究人员鉴定出UHRF1是介导RAD52降解的E3泛素连接酶。UHRF1与CPSF6共敲低可挽救CPSF6缺失引起的RAD52减少。过表达野生型UHRF1而非连接酶失活突变体（H741A）促进RAD52 K48连接泛素化，而UHRF1敲低则抑制该过程。体外竞争实验表明，CPSF6和UHRF1竞争性结合RAD52：增加UHRF1削弱CPSF6–RAD52相互作用，而增加CPSF6则减弱UHRF1–RAD52结合。结构域分析显示RAD52的N端160个氨基酸是与UHRF1结合所必需且充分的，而CPSF6–RAD52相互作用需要两蛋白的完整结构。
### CPSF6 promotes RAD51 recruitment and RAD51–RPA exchange
CPSF6缺失在BLM、EPI和ETO处理后增加RPA灶的形成，但不影响ssDNA的产生（BrdU标记实验）。同时，CPSF6缺失损害RAD51在染色质上的招募和RAD51灶形成，且这一作用与RAD52降解无关。表位分析实验显示，CPSF6与BRCA2在调控RAD51招募中呈现加性效应，而与TOPBP1则表现为上位遗传关系，表明CPSF6通过TOPBP1相关通路而非BRCA2通路促进RAD51招募。
### CPSF6 promotes RAD51 recruitment through ATR–CHK1–PLK1 pathway
CPSF6缺失不影响TOPBP1向损伤位点的招募，也不与TOPBP1直接相互作用，提示其在TOPBP1下游发挥作用。在多种细胞系和多种药物处理后，CPSF6缺失均损害CHK1在丝氨酸345位点的磷酸化，但不影响ATR在苏氨酸1989位点的自身磷酸化，也不影响ATR介导的RPA磷酸化。CPSF6的13RA突变体（相分离缺陷）仍能回补RAD52稳定性和CHK1激活。此外，CPSF6缺失抑制ETO诱导的PLK1磷酸化以及PLK1–TOPBP1和PLK1–RAD51相互作用。
### CPSF6 functions as a mediator to promote ATR–CHK1 interaction
CPSF6与CHK1相互作用，且该相互作用在DNA损伤后随CHK1磷酸化而减弱。CPSF6与磷酸化缺陷型CHK1-S345A突变体的结合显著增强。CPSF6缺失仍能降低构成性激活的CHK1-L449R构象突变体和CHK1 C端截短突变体的磷酸化水平，表明CPSF6独立于CHK1构象调控和CLASPIN发挥作用。CPSF6结合CHK1的C端调控结构域而非N端激酶结构域。在DNA损伤后，CPSF6同时与ATR和CHK1相互作用，并可体外直接促进ATR–CHK1结合。CPSF6缺失削弱损伤诱导的ATR–CHK1相互作用。
### CPSF6 resolves TRCs to maintain genomic stability
CPSF6缺失在生理条件下导致S9.6抗体检测的R-loop显著积累，可被外源CPSF6回补。CPSF6缺失增加染色质桥形成，而RNA聚合酶II转录延伸抑制剂DRB可消除该现象。在早期S期——TRC高频发生的时期，CPSF6缺失诱导γH2AX灶显著增多，同样可被DRB和外源CPSF6所挽救。这些结果共同表明，CPSF6通过解除TRC维持基因组稳定性。
## 五、讨论与结论
讨论部分指出，该研究首次揭示了UHRF1作为E3连接酶通过K48连接泛素化介导RAD52蛋白降解的新功能，拓展了UHRF1在DDR中的作用谱系。同时，CPSF6作为介导因子促进ATR–CHK1相互作用，在经典CLASPIN途径之外为ATR–CHK1信号轴提供了又一调控层级。CPSF6与CHK1的相互作用因CHK1磷酸化而减弱，这种负反馈调控可能有助于激活的CHK1释放以放大DNA损伤信号。相分离缺陷型CPSF6突变体仍能回补DDR功能，表明CPSF6在DDR中的作用不依赖于其经典加工功能。尽管不能完全排除CPSF6介导的pre-mRNA加工参与预防R-loop积累的可能，但鉴于RAD52和CHK1均已知参与TRC解除，研究人员的发现支持CPSF6通过稳定RAD52和促进CHK1激活来解除TRC的模型。
综上，该研究确立了CPSF6作为DDR关键因子的新身份。CPSF6通过双重机制——保护RAD52免受UHRF1介导的蛋白酶体降解和促进ATR–CHK1相互作用以激活CHK1–PLK1–RAD51通路——在TRC解除和基因组稳定性维持中发挥关键作用，这些功能独立于其在pre-mRNA 3′-端加工的经典角色，为理解基因组稳定性调控网络提供了新的视角。
