《Reproductive Medicine》：Know Your DUCs: Direct Unequal Cleavage Subtypes Are Associated with Distinct Preimplantation Developmental Patterns
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背景/目的：直接不均等卵裂（direct unequal cleavage，DUC）通常被视为胚胎能力不佳的标志。然而，越来越多的证据表明，DUC代表一组异质性的发育异常，而非单一的生物学实体。本研究旨在表征各DUC亚型之间的发育差异，并描述性探索移植胚胎子集
背景/目的：直接不均等卵裂（direct unequal cleavage，DUC）通常被视为胚胎能力不佳的标志。然而，越来越多的证据表明，DUC代表一组异质性的发育异常，而非单一的生物学实体。本研究旨在表征各DUC亚型之间的发育差异，并描述性探索移植胚胎子集中的着床和活产结局。方法：这项回顾性研究纳入了505例患者的1381枚DUC胚胎，涉及532个治疗周期，于2022年3月至2023年2月期间在单一体外受精中心使用时序成像（EmbryoScope+?）进行培养。DUC胚胎由CHLOE-EQ人工智能平台自动识别，并由经验丰富的胚胎学家将其分为六种DUC亚型。比较了各DUC亚型之间的发育动力学、人工智能衍生的质量评分和囊胚形成评分，并描述了临床结局。结果：在考虑胚胎在患者内的聚集性后，DUC亚型与囊胚形成显著相关（Wald χ2(5) = 118.00，p < 0.001）。DUC1（83/227，36.6%）和主要混沌DUC（Major Chaotic DUC）（76/203，37.4%）胚胎的囊胚形成率最低，人工智能衍生的胚胎质量评分较低，预测囊胚形成潜力也较低。DUC2、间接DUC（Indirect DUC）和次要混沌DUC（Minor Chaotic DUC）胚胎的囊胚形成率约为67–72%。37例冻融单胚胎移植的临床结局可用并进行了描述性报告：27/37例（73.0%；精确95% CI 55.9–86.2%）发生着床，20/37例（54.1%；精确95% CI 36.9–70.5%）获得活产。CHLOE-Blast对观察到的囊胚形成显示出中等到良好的区分能力（AUC = 0.769；95% CI 0.741–0.796），尽管校准斜率为0.585表明预测值比观察结果更为极端。形态动力学分析确定了DUC亚型之间早期发育间隔的总体差异，而在达到后期发育阶段的胚胎中，未检测到后期发育阶段的显著差异。结论：DUC亚型与不同的囊胚形成率和发育模式相关。即使在调整了胚胎在患者内的聚集性后，DUC1和主要混沌DUC仍与最低的囊胚形成率和最低的人工智能衍生评分相关。移植选自多个DUC亚型的胚胎后发生了活产；然而，有限且高度选择的临床样本排除了亚型间生殖潜力的比较。这些发现支持对DUC胚胎进行更差异化的评估，而需要更大规模的研究来确定其临床预后。
论文解读
一、研究背景与问题
在辅助生殖技术中，胚胎培养与评估是至关重要的环节。传统上，胚胎质量评估需要每天将胚胎从标准培养箱中取出进行显微镜检查。近年来，时序成像系统（time-lapse imaging，TLI）的引入使得胚胎学家能够在预设时间间隔内连续采集胚胎发育的数字图像，从而获得胚胎形态动力学（morphokinetics）的详细信息。TLI改善了胚胎发育动态的表征，使得常规评估中可能无法检测到的异常卵裂模式和其他发育事件得以识别。此外，包括卵裂时间和卵裂球同步性在内的多个形态动力学参数已被证明与胚胎活力、着床潜力和染色体状态相关，提示TLI在优化胚胎选择策略方面具有潜在作用。然而，TLI对生殖结局的临床影响仍存在争议。
正常胚胎卵裂在一个约10–12小时的细胞周期内产生两个大小相似的子细胞。在已描述的非典型卵裂模式中，直接不均等卵裂（direct unequal cleavage，DUC）因其与不良发育和生殖结局的强关联而受到广泛关注。DUC的特征是单个卵裂球直接分裂为三个或更多子细胞，或细胞周期间隔异常缩短至5小时或更短。这种异常卵裂模式一直与囊胚形成受损、着床潜力降低、非整倍体率增加以及最终较低的妊娠率和活产率相关。
尽管DUC传统上被视为单一类别的异常卵裂，但越来越多的证据表明，直接卵裂事件在生物学上是异质性的，其发育能力和临床潜力可能存在显著差异。目前已描述了几种DUC亚分类，包括DUC1、DUC2、间接DUC（Indirect DUC）、碎片化假DUC1（Fragmented False DUC1）和混沌DUC（chaotic DUC）模式。DUC1的特征是单个卵裂球直接分裂为三个大小相似的子细胞。碎片化假DUC1与常规DUC1非常相似，但其第三个细胞单位是碎片而非完整细胞。相比之下，DUC2发生在正常第一次分裂之后，其中一个卵裂球随后分裂为三个子细胞。间接DUC指在异常短的时间间隔内发生的外观正常的连续分裂，而混沌DUC涵盖高度不规则的卵裂模式，可根据紊乱程度分为次要或主要形式。
这种异质性的生物学基础仍未完全阐明，但被认为涉及有丝分裂过程中纺锤体组装和染色体分离的异常。三极有丝分裂被认为是直接卵裂事件的主要机制之一，导致子卵裂球之间染色体分配不均，产生复杂非整倍体或嵌合胚胎。中心体功能缺陷、纺锤体组织异常、胞质分裂异常、减数分裂纺锤体形成缺陷以及受精后父源中心体贡献异常也可能使胚胎易发生非典型卵裂行为和基因组不稳定。
既往研究已表明，这些DUC亚分类在囊胚形成、胚胎利用（移植或冷冻保存）和染色体状态方面存在显著差异。在研究人员先前的回顾性队列研究中，DUC1、主要混沌DUC和碎片化假DUC1胚胎与DUC2、次要混沌DUC和间接DUC胚胎相比，囊胚形成受损、利用率较低且整倍体状态较差。这些发现表明，DUC亚分类不仅在形态动力学特征上存在差异，在发育和染色体能力方面也存在差异。然而，尽管支持DUC生物学异质性的证据日益增多，但各DUC亚型与临床相关结局（如着床和活产）之间的关联仍知之甚少。本研究旨在表征六种DUC亚型之间的发育差异，以囊胚形成为主要结局，人工智能衍生的胚胎评分和形态动力学参数作为次要结局，着床和活产结局作为探索性发现。
二、研究设计与技术方法
本研究为回顾性研究，纳入了来自西班牙一家私人诊所的TLI数据。研究包括1381枚由人工智能模型CHLOE-EQ识别的DUC胚胎的时间延迟视频，来自505例患者、532个治疗周期，培养时间为2022年3月至2023年2月。胚胎在EmbryoScope+?时序培养箱中培养，图像在11个焦平面采集。卵母细胞通过卵胞浆内单精子注射受精。胚胎学家基于标准形态学和临床标准做出移植决定，且对DUC亚型分类不知情。临床队列包括37例冻融单囊胚移植。
关键技术方法包括：第一，CHLOE-EQ深度学习胚胎评估人工智能模型，用于预测囊胚形成、胚胎利用和着床可能性，并提供关键形态动力学阶段（morphokinetic stage，MKS）时间戳、胚胎质量排序、胚胎质量评分、囊胚形成可能性评分以及发育异常注释。第二，DUC胚胎的注释与分类，由人工智能模型自动注释后，由三位资深胚胎学家独立分类为六种亚型，分类不一致时通过共同审查达成共识。第三，统计分析采用群体平均逻辑回归模型配合患者聚集稳健标准误评估DUC亚型与囊胚形成的关联，使用边际线性回归模型分析连续评分和形态动力学参数，通过受试者工作特征曲线评估CHLOE-Blast的区分能力，并评估校准截距、校准斜率、Brier评分和校准图。
三、研究结果
3.1 胚胎初始分析
DUC亚型分布不均：次要混沌DUC占26%（354/1381），间接DUC占25%（343/1381），DUC1占16%（227/1381），DUC2占16%（223/1381），主要混沌DUC占15%（203/1381），碎片化假DUC1占2%（31/1381）。在考虑胚胎在患者内的聚集性后，各DUC亚型之间的卵母细胞年龄无显著差异（Wald χ2(5) = 3.16，p = 0.676）。
3.2 DUC亚型的囊胚形成与探索性临床结局
总体而言，817/1381枚胚胎（59.2%）达到至少早期囊胚阶段。在考虑胚胎在患者内的聚集性后，DUC亚型与囊胚形成显著相关（Wald χ2(5) = 118.00，p < 0.001），在调整卵母细胞年龄和使用治疗周期作为聚集单位后，该关联仍然显著。观察到的囊胚形成率分别为：DUC1为36.6%，DUC2为69.1%，次要混沌DUC为67.2%，主要混沌DUC为37.4%，碎片化假DUC1为58.1%，间接DUC为72.3%。经Holm校正后，DUC1和主要混沌DUC的囊胚形成概率显著低于DUC2、次要混沌DUC和间接DUC。DUC1与主要混沌DUC之间以及DUC2、次要混沌DUC和间接DUC之间无显著差异。利用胚胎（定义为冷冻保存胚胎）的比例也因亚型而异。临床结局方面，37例冻融单胚胎移植中，着床27例（73.0%），活产20例（54.1%）。按亚型统计，无主要混沌DUC胚胎被移植。
3.3 CHLOE-EQ和CHLOE-Blast评分
CHLOE-EQ评分在考虑聚集性后在各DUC亚型间存在显著差异（Wald χ2(5) = 270.18，p < 0.001）。DUC1（0.090 ± 0.205）和主要混沌DUC（0.103 ± 0.210）胚胎的平均评分低于DUC2（0.383 ± 0.390）、次要混沌DUC（0.358 ± 0.385）和间接DUC（0.433 ± 0.401）胚胎。第3天预测囊胚形成评分（CHLOE-Blast）也存在显著差异（Wald χ2(5) = 124.59，p < 0.001），DUC1（0.483 ± 0.279）和主要混沌DUC（0.415 ± 0.281）的平均评分低于其他亚型。
3.4 观察与预测的囊胚形成
CHLOE-Blast对观察到的囊胚形成显示出中等到良好的区分能力（AUC = 0.769；95% CI 0.741–0.796）。Brier评分为0.197，校准截距为0.107，校准斜率为0.585，表明预测值比观察结果更为极端，评分更适合对胚胎进行排序而非报告绝对囊胚形成概率。
3.5 DUC亚型的形态动力学参数
从原核消失到首次观察到的卵裂事件的时间间隔在各亚型间存在显著差异（p < 0.001），CC2（t3?t2）也存在显著差异（p < 0.001）。碎片化假DUC1和主要混沌DUC胚胎的平均间隔最长，而DUC2和间接DUC胚胎的平均间隔最短。S2（t4?t3）也显示出显著的总体差异（p < 0.001），但配对比较在未转换和对数转换分析之间不稳定。CC3（t5?t3；p = 0.078）、S3（t8?t5；p = 0.193）和tEB?tSB（p = 0.270）未检测到显著差异。
四、讨论与结论
本研究的核心发现是DUC亚型与不同的囊胚形成率和人工智能衍生发育评分相关。DUC1和主要混沌DUC与最低的囊胚形成率和最低的CHLOE-EQ和CHLOE-Blast评分相关，这一关联在考虑胚胎在患者内的聚集性后、调整卵母细胞年龄后以及使用治疗周期作为聚集单位后均持续存在。人工智能决策支持模型可能通过自动标记DUC胚胎和预测囊胚形成可能性来辅助胚胎学家，但不应取代胚胎学家对DUC亚型的亚分类。临床结局显示，选自多个DUC亚型的胚胎可以导致活产，但样本量小且高度选择，不支持亚型间生殖潜力的比较。形态动力学发现也应谨慎解释，因为并非所有胚胎都有可用的间隔数据，且某些间隔可能不代表跨DUC亚型生物学等效的事件。
研究存在若干局限性：某些DUC亚型的样本量较小，特别是移植胚胎的着床和活产结局；碎片与细胞的区分具有挑战性，误分类可能导致碎片化假DUC1被误认为真正的DUC1；个体分类未被保留，无法量化观察者间一致性；胚胎学家无法对囊胚形成设盲；对呈现多种异常特征的胚胎未应用正式的层级或决策规则；某些形态动力学间隔表现出显著离散性，且未应用正式的离群值排除规则；CHLOE评分虽介于0和1之间，但使用线性模型而非有界结局模型分析。
研究结论：DUC代表一组异质性的卵裂异常，与不同的植入前发育模式相关。DUC1和主要混沌DUC胚胎与最低的囊胚形成率（36.6%和37.4%）和最低的人工智能衍生评分相关，即使在调整胚胎在患者内的聚集性后也是如此，而DUC2、次要混沌DUC和间接DUC显示出相对较高的囊胚形成概率（67.2–72.3%）。选定的DUC胚胎可实现着床和活产，这仅表明部分选定的DUC胚胎能够实现这些结局，并非亚型间生殖潜力差异的证据。这些发现支持将DUC视为异质性发育现象而非单一类别。然而，由于移植队列样本量小且高度选择，临床结局仍属探索性。
