孟加拉国孙德尔本红树林沉积物及亲虾分离的四种潜在土著益生菌全基因组序列分析

《Microbiology Resource Announcements》：Whole genome sequences of four potential indigenous probiotics strains isolated from sediment of Sundarbans mangrove and wild black tiger shrimp (Penaeus monodon) from the Bay of Bengal, Bangladesh

　　

摘要

在此，我们报道了四种潜在土著益生菌的全基因组序列：Photobacterium ganghwense MSR_IP16、Bacillus subtilis MSR_IP31，以及两株Bacillus velezensis（MSR_IP55和MSR_IP80），它们分别分离自孟加拉国科克斯巴扎尔孟加拉湾的孙德尔本红树林沉积物及亲虾。基因组组装大小范围为3.9至5.3 Mb，分别包含19至44个contig。

公告

益生菌因其能够抑制病原体、促进生长并刺激宿主免疫反应（1–3），被广泛用作虾类养殖中替代抗生素的可持续方案。在本研究中，Photobacterium ganghwense MSR_IP16和Bacillus subtilis MSR_IP31分离自孟加拉国库斯沙地区的孙德尔本红树林沉积物，Bacillus velezensis MSR_IP55和MSR_IP80菌株分离自孟加拉国科克斯巴扎尔孟加拉湾采集的黑虎虾。

样品在37°C的芽孢杆菌琼脂平板（HiMedia，美国）上培养24小时以分离潜在益生菌株，并通过重复划线进行纯化。随后，菌株通过一系列生化试验进行鉴定（4，5），并进行体外拮抗活性检测（6）、安全性和耐受性试验（7–9）。为提取高质量基因组DNA，将这四种菌株的单菌落接种于TSA平板，37°C培养24小时。使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒（Promega，美国）提取基因组DNA，采用Nextera XT DNA文库制备试剂盒（Illumina，美国）制备文库，并在Illumina MiSeq平台（Illumina，美国）上进行150 bp双端全基因组测序。使用Trim-galore v0.6.10（10）去除接头和低质量reads，使用FastQC v0.12.1（11）评估质量。基因组使用SPAdes v4.2.0（12）组装，并使用Pilon v1.24（13）进行抛光。基因组完整性和污染水平使用CheckM v1.2.5（14）确定。组装基因组的品质和覆盖度使用Quast v5.3.0（15）和Qualimap v2.3（16）评估。分类学鉴定和平均核苷酸一致性（ANI）使用AutoMLST（https://automlst.ziemertlab.com/）（17）确定。基因组注释使用Bakta v1.3.0（18）和Prokka v1.12（19）进行，代谢特征、CRISPR阵列、抗菌抗性基因和原噬菌体分别使用RAST server（https://rast.nmpdr.org/rast.cgi）（20）、CRISPR/CasFinder v1.1.0（21）、ResFinder v4.7.2（22）、CARD RGI v1.4.2（23）和PHASTEST v1.0.2（24）鉴定。毒力相关基因和质粒的存在使用VFanalyzer v6.0（25）和PlasmidFinder v3.0.3（26）检测。环状基因组图谱使用Proksee生成（版本：2026年6月22日；https://proksee.ca/）（27）。除特别说明外，所有软件均使用默认参数。

四种潜在土著益生菌的菌株信息和基因组特征汇总于表1。基因组注释进一步揭示了各菌株在编码和非编码遗传元素方面的差异（图1）。值得注意的是，仅在P. ganghwense MSR_IP16中检测到CRISPR阵列，表明其存在适应性免疫防御机制。此外，在所有四个基因组中均未检测到抗生素抗性基因和质粒。总体而言，基因组特征结合生化试验、拮抗活性、安全性和耐受性试验的结果，证实了这些菌株具有优良的益生菌特性，为可持续虾类养殖提供了有前景且安全的益生菌候选菌株。

表1

表1 从孟加拉国库斯沙孙德尔本红树林地区沉积物及科克斯巴扎尔孟加拉湾亲虾中分离的四种潜在土著益生菌的简略基因组序列汇总

变量	菌株数据
	MSR_IP16	MSR_IP31	MSR_IP55	MSR_IP80
参考数据库中最接近的系统发育亲缘种	Photobacterium ganghwense JCM 12487	Bacillus subtilis 128	Bacillus velezensis NRRL B-41580
与模式株的ANI	98.70%	98.50%	97.80%	98.70%
分离来源	沉积物		亲虾
来源地点	孙德尔本红树林		孟加拉湾
地理位置	孟加拉国库斯沙		孟加拉国科克斯巴扎尔
地理坐标	22°16′35.40″N 89°24′07.36″E	22°17′20.39″N 89°23′29.12″E	21°11′08.81″N 91°52′15.01″E
双端reads数（150 bp × 2）	66,710	67,244	77,121	73,922
基因组大小（bp）	5,399,468	4,110,319	3,994,787	3,958,896
Contigs数	44	21	19	26
最大contig（bp）	1,201,170	1,106,134	1,079,983	1,080,237
基因组完整性（%）	94.46	99.41	99.41	99.41
污染水平（%）	4.27	0.52	0.05	0.19
基因组覆盖度（×）	35.94	48.33	59.54	54.95
GC含量（%）	50.74	43.46	46.38	46.43
N50（bp）	848,135	1,042,139	984,658	997,279
基因数	4,997	4,261	3,988	3,947
CDS数	4,809	4,143	3,875	3,835
rRNA数	14	17	13	11
tRNA数	163	84	85	86
tmRNA数	1	1	1	1
非编码RNA（ncRNA）数	23	30	20	20
ncRNA区域数	31	66	60	60
CRISPR阵列数	2	0	0	0
小开放阅读框数	0	4	4	4
复制起始位点（oriC）数	1	2	2	3
假基因数	10	16	14	14
BioSample登录号	SAMN61029141	SAMN61029142	SAMN61029143	SAMN61029144
序列读库归档（SRA）	SRR39247004	SRR39247003	SRR39247002	SRR39247001

图1

图1 从沉积物和虾样品中分离的四种潜在土著益生菌的环状基因组表征。（a）Photobacterium ganghwense MSR_IP16，（b）Bacillus subtilis MSR_IP31，（c）Bacillus velezensis MSR_IP55，（d）Bacillus velezensis MSR_IP80。

致谢

作者感谢孟加拉人民共和国渔业与畜牧业部渔业局提供的资金支持，该项目子项目为"孟加拉国可持续虾类养殖中的虾苗场本土益生菌生产与分发"（资助编号：SCMFP_L3W1-23），属于世界银行集团资助的可持续沿海与海洋渔业项目（SCMFP）。

作者还感谢FishTech Hatchery Limited、New Royal Shrimp Hatchery、New Bagda Gold Shrimp Hatchery和New Rupali Shrimp Hatchery在项目活动期间的慷慨协助。