《Annals of Hepatology》：ISG-15 promotes de novo HBV infection after pediatric liver transplant via IL-18/STAT1 from HBcAb-positive donors
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引言与目的：肝移植是儿童终末期肝病的主要治疗手段，但使用乙型肝炎核心抗体阳性（HBcAb+）移植物会增加新发乙型肝炎病毒（HBV）感染风险。研究人员检验了干扰素刺激基因15（ISG-15）是否通过白细胞介素18（IL-18）/信号转导及转录激活因子1（STAT
引言与目的：肝移植是儿童终末期肝病的主要治疗手段，但使用乙型肝炎核心抗体阳性（HBcAb+）移植物会增加新发乙型肝炎病毒（HBV）感染风险。研究人员检验了干扰素刺激基因15（ISG-15）是否通过白细胞介素18（IL-18）/信号转导及转录激活因子1（STAT1）信号通路促进新发HBV感染。
患者与方法：研究人员回顾性分析临床数据并开展蛋白质组学分析。从2018—2019年接受肝移植的儿童受者中随机选取8例发生新发HBV感染和10例未发生新发HBV感染的肝活检标本。在新发与非新发HBV组间的蛋白质组学比较中，研究人员鉴定出5027种蛋白质，包括221种差异表达蛋白质。采用基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析评估功能关联。
结果：差异表达蛋白质主要参与免疫应答、病毒防御和细胞黏附过程。利用小干扰RNA（siRNA）和质粒转染在肝母细胞瘤（HepG2.2.15）细胞中敲低和过表达ISG-15的体外实验表明，ISG-15过表达显著增强细胞增殖和迁移，而ISG-15敲低抑制这些生物学过程。使用STAT1抑制剂氟达拉滨（fludarabine）和激动剂2-硝基丙烷（2-nitropropane）处理进一步证实，ISG-15通过调控IL-18/STAT1信号轴促进HBV复制。
结论：本研究结果为理解ISG-15在HBV感染中的作用提供了实验证据，并为临床干预以预防使用HBcAb阳性供肝肝移植后新发HBV感染提供了潜在靶点。
研究背景方面，儿童肝移植是儿童终末期肝病的主要治疗方式，但供肝短缺促使移植中心扩大儿童供者池，使用乙型肝炎核心抗体（HBcAb，针对HBV核心抗原的抗体）阳性供者移植物是扩大供者来源的重要策略。中国HBV高流行，乙型肝炎表面抗原（HBsAg，HBV感染标志物）阳性率为5.86%，估计约7500万人感染。成人中因HBV相关疾病常为移植指征且术后常规预防，HBcAb阳性供肝问题相对不突出；儿童肝移植多用于非HBV相关疾病，受者接受HBcAb阳性供肝后存在新发HBV感染风险。因此，理解儿童肝移植后新发HBV感染的机制并进行早期有效干预，对扩大儿童供者池和改善长期结局具有重要意义。研究人员整合回顾性临床数据及肝活检蛋白质组学和实验分析，发现ISG-15（干扰素刺激基因15，干扰素诱导的泛素样蛋白）通过激活IL-18（白细胞介素18，IL-1细胞因子家族成员）/STAT1（信号转导及转录激活因子1）轴促进移植后新发HBV感染，为临床预防提供新见解和潜在靶点。
主要关键技术方法概括：研究人员采用单中心（天津第一中心医院）回顾性队列分析，纳入2013年5月至2023年12月571例接受HBcAb阳性供肝的儿童肝移植受者，其中26例发生新发HBV感染；对2018—2019年移植受者中随机选取的8例新发HBV感染和10例对照肝活检标本进行定量蛋白质组学（LC-MS/MS，液相色谱-串联质谱）及GO、KEGG和蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析；在HepG2.2.15细胞中采用siRNA（小干扰RNA）和质粒转染敲低/过表达ISG-15，结合CCK-8（细胞计数试剂盒-8）、划痕实验、ELISA（酶联免疫吸附试验）、qPCR（定量聚合酶链反应）、蛋白质印迹和免疫组化（IHC）验证，并用STAT1抑制剂氟达拉滨和激动剂2-硝基丙烷（2-NP）干预。
研究结果：3.1 基本患者信息（Basic Patient Information）：2013年5月至2023年12月共完成1836例儿童肝移植，571例供者术前HBcAb阳性（约31%），所有供者HBsAg阴性；供者297男274女，中位年龄31.99岁；受者280男291女，中位年龄8.47个月；原发病中胆道闭锁496例、其他75例。3.2 儿童肝移植后新发HBV感染发生率（Incidence of De Novo HBV Infection After Pediatric Liver Transplantation）：571例受者中26例发生新发HBV感染，发生率4.55%；11男15女，移植中位年龄7.50个月，中位感染时间16个月；基线特征无显著差异。多因素logistic回归显示供者年龄较高增加感染风险（每10年OR=1.499，95%CI 1.097–2.048，P=0.011），受者年龄较大、移植物受者体重比（GRWR）较高和移植前乙型肝炎表面抗体（HBsAb）阳性降低风险（OR分别为0.969、0.528、0.211），供者类型无显著影响（P=0.120）。3.3 儿童肝移植受者新发HBV感染的诊断与治疗（Diagnosis and Treatment of De Novo HBV Infection in Pediatric Liver Transplant Recipients）：26例均HBsAg阳性，22例HBV DNA阳性、4例阴性；诊断时2例肝功能异常；1年生存率100%，移植物生存率96.2%；1例HBsAg和HBV DNA持续清除4年，但6年后因抗体介导排斥致移植物失败需再移植；23例接受恩替卡韦治疗，其中18例HBsAg和HBV DNA不可测，2例HBV DNA不可测，3例未转阴；其余3例分别接受拉米夫定及干扰素联合恩替卡韦，均HBsAg和HBV DNA不可测；治疗后HBsAg清除中位14个月，HBV DNA清除中位6个月。3.4 定量蛋白质组学分析（Quantitative Proteomics Analysis）：8例感染和10例未感染受者肝活检中鉴定5027种蛋白，221种差异表达（152上调、69下调）；聚类显示组间蛋白表达谱不同；GO分析显示上调蛋白与中性粒细胞脱颗粒、免疫应答和I型干扰素信号相关，主要定位于外泌体，下调蛋白参与代谢、胞质/线粒体定位和蛋白结合；KEGG通路包括黏着斑、PI3K-Akt信号和ECM-受体相互作用。3.5 ISG-15/IL-18/STAT1信号轴参与儿童肝移植后新发HBV感染发生（ISG-15/IL-18/STAT1 Signaling Axis Involved in Onset of De Novo HBV Infection After Pediatric Liver Transplantation）：PPI分析显示ISG-15和STAT1处于中心位置，IL-18上调并参与免疫和病毒通路；IHC和蛋白质印迹证实新发HBV组ISG-15、IL-18、STAT1表达显著高于对照（P<0.05）。3.6 ISG-15敲低/过表达模型建立（Establishment of ISG-15 Knockdown/Overexpression Model）：HepG2.2.15细胞中ISG-15、IL-18、STAT1蛋白显著高于HepG2细胞；siRNA和质粒转染有效改变ISG-15表达，siRNA3抑制最显著并用于后续敲低实验。3.7 ISG-15通过IL-18/STAT1信号轴影响HBV复制（ISG-15 Affects HBV Replication Through the IL-18/STAT1 Signaling Axis）：敲低/过表达ISG-15后IL-18和STAT1表达相应降低/升高（P<0.05），HBV DNA亦降低/升高；ELISA显示过表达ISG-15细胞上清HBsAg、HBeAg（乙型肝炎e抗原）和IFN-α（干扰素α）显著高于对照（P<0.01）。3.8 过表达ISG-15增强HepG2.2.15细胞增殖和迁移（Overexpression of ISG-15 Enhances Proliferation and Migration of HepG2.2.15 Cells）：CCK-8显示48和72 h时敲低ISG-15降低增殖、过表达增强增殖（P<0.05）；划痕实验显示24和48 h时敲低降低迁移、过表达增强迁移（P<0.05）。3.9 STAT1抑制剂和激动剂对ISG-15调节的影响（Effect of STAT1 Inhibitor and Agonist on ISG-15 Regulation）：氟达拉滨处理ISG-15过表达细胞后HBV DNA、HBsAg、HBeAg和IFN-α降低，2-NP处理ISG-15敲低细胞后上述标志物升高，提示ISG-15通过IL-18/STAT1轴促进HBV复制。
讨论部分总结：中国儿童肝移植数量逐年增加，本中心生存率与国际水平相当；HBcAb阳性供肝可扩大供者池，但新发HBV感染是主要风险。中国HBcAb阳性率较高，本中心既往活体供者HBcAb阳性率为43.6%，未预防儿童受者新发HBV感染发生率达38.5%；儿童免疫系统不成熟且免疫抑制治疗增加易感性，故使用HBcAb阳性供肝时需预防策略和严密围手术期监测。本研究的局限性包括单中心回顾性队列可能存在选择偏倚，机制分析样本量较小（8例新发HBV vs 10例对照），仅部分571例受者有合格肝活检标本，无法在全队列进行qPCR、蛋白质印迹或IHC验证；HepG2.2.15永生化HBV复制肝癌细胞不能完全再现复杂移植后免疫和免疫抑制环境下供者来源HBV对初始肝细胞的感染；部分关键临床变量如免疫抑制方案一致性和患者依从性未能纳入多因素回归。未来需前瞻性多中心队列、标准化组织采集和纵向随访验证ISG-15/IL-18/STAT1轴的临床相关性，并用原代人肝细胞、HBV易感肝类器官或AAV-HBV小鼠模型提供更生理相关证据。讨论还指出，Hoan等报道HBV患者血清ISG-15升高并与HBV相关肝病正相关，与本研究一致；ISG-15作为干扰素诱导的泛素样蛋白，通过C端Gly-Gly基序共价连接靶蛋白（ISGylation）参与抗病毒天然免疫，既有抗病毒研究，也有研究显示ISG-15/ISGylation可刺激丙型肝炎病毒产生并增加培养上清HBV DNA，与本研究过表达ISG-15增加HepG2.2.15细胞HBV DNA一致。ISG-15可修饰JAK1和STAT1，STAT1作为其底物可被修饰以防止多聚泛素化和蛋白酶体降解，从而维持活性并延长免疫信号；本研究中过表达ISG-15细胞STAT1显著升高。IL-18由巨噬细胞和树突状细胞产生，调节免疫并与自身免疫病、感染和癌症相关，一些病毒通过抑制IL-18产生逃逸免疫；本研究发现ISG-15敲低显著降低IL-18，提示IL-18可能是ISG-15促进新发HBV感染的关键下游蛋白。Wittmann等证明IL-18/STAT1信号在免疫调节中关键，IL-18诱导IFN-γ释放并激活JAK–STAT1通路；本研究临床和实验数据显示ISG-15上调IL-18，增强IFN-γ产生和STAT1活化，STAT1抑制剂/激动剂实验证实STAT1活性调节HBV DNA、IFN-α、HBeAg和HBsAg，支持ISG-15–IL-18–STAT1轴介导HBcAb阳性供肝相关新发HBV感染。研究结论翻译：本研究揭示ISG-15通过IL-18/STAT1信号轴在促进儿童肝移植后新发HBV感染中发挥关键作用；研究人员鉴定了与ISG-15相关的潜在信号通路和差异表达蛋白，为新发HBV感染机制提供新见解；进一步研究应探索这些经验证的差异蛋白的功能及其参与的信号通路。
