基于RUBY可视化报告基因的银杏（Ginkgo biloba）叶片高效瞬时转化体系及其在类黄酮生物合成功能解析中的应用

《aBIOTECH》：An efficient RUBY-based transient transformation system in Ginkgo biloba leaves facilitates functional dissection of flavonoid biosynthesis

　　

银杏（Ginkgo biloba）是一种富含类黄酮（flavonoids）及其他具有药用价值次生代谢产物的裸子植物。然而，由于缺乏高效的遗传转化体系，银杏的功能研究受到限制。研究人员建立了快速的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的银杏叶片瞬时转化体系，并利用RUBY报告基因（RUBY reporter）和紫外激发绿色荧光蛋白（UV-GFP）报告系统对基因功能进行无损分析。在所测试的根癌农杆菌菌株中，AGL1最为有效，而GV3101未能实现转化。使用播种后约40天幼苗的叶片、OD₆₀₀为0.6的根癌农杆菌悬液以及含5 mM二硫苏糖醇（DTT）且pH 5.8的侵染缓冲液可获得最佳转化效率。利用该系统，研究人员分别将两个黄酮醇合酶（flavonol synthase, FLS）基因（GbFLS；Gb_01811和Gb_06949）瞬时过表达，表达量分别提高6.75倍和2.37倍，使叶片类黄酮含量分别增加15.6%和24.0%。对转录因子基因GbMYB123的表征表明，其瞬时过表达促进类黄酮生物合成，而瞬时沉默则降低类黄酮积累。对GbMYB123过表达叶片的转录组分析显示，苯丙烷（phenylpropanoid）和类黄酮途径中的基因显著上调。GbMYB123的调控作用进一步通过拟南芥（Arabidopsis thaliana）和杨树（poplar）的稳定转化以及银杏愈伤组织的瞬时转化得到证实。研究人员得出结论：基于RUBY的瞬时转化体系为银杏基因功能分析提供了高效平台，并可能促进其他难转化木本物种的转化研究。

研究背景与目的：银杏（Ginkgo biloba）是古老裸子植物和全球栽培的工业树种，叶片富含类黄酮（flavonoids）和萜内酯等次生代谢物，具有药用和经济价值。叶片是银杏类黄酮生物合成和积累的主要器官。然而，银杏稳定遗传转化体系尚未建立，现有瞬时转化方法效率低且不稳定；转录组等高通量研究虽鉴定大量候选基因，但功能验证主要依赖拟南芥（Arabidopsis thaliana）和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）等异源系统。因银杏为裸子植物而模式植物为被子植物，进化差异可能使异源系统不能充分反映银杏独特遗传背景、前体可利用性和代谢调控网络。已有银杏叶肉原生质体瞬时表达需酶解细胞壁，可能破坏天然组织结构和细胞间通讯，改变内源生理响应。传统报告系统中，β-葡萄糖苷酸酶（GUS）检测具破坏性且耗时，绿色荧光蛋白（GFP）需专门成像设备，而银杏叶富含酚类物质，自发荧光可致信号模糊或假阳性。RUBY报告基因通过共表达CYP76AD1、DODA和糖基转移酶，将内源酪氨酸转化为红色甜菜红素，肉眼可见，适于无损、实时、无底物评估。因此，研究人员建立完整叶片瞬时转化体系，以RUBY为可见标记优化参数，并用于GbFLS和GbMYB123功能解析。

关键技术方法（≤250字）：研究人员以采自扬州大学银杏实验基地的银杏种子萌发幼苗叶片为材料，建立根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的整叶注射瞬时转化体系，并以RUBY和UV-GFP（紫外激发绿色荧光蛋白）报告系统可视化评估转化。围绕菌株、OD₆₀₀、侵染液pH、二硫苏糖醇（DTT）和苗龄优化参数；采用逆转录定量PCR（RT–qPCR）和总类黄酮含量测定验证基因功能；通过RNA测序（RNA-seq）、差异表达基因（DEGs）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析鉴定下游候选；利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）进行内源沉默验证；并在拟南芥rdr6背景、84K杨稳定转化及银杏愈伤瞬时转化中交叉验证。

研究结果：
2.1. Agrobacterium-mediated transient transformation of G. biloba leaves：比较GV3101和AGL1菌株，RUBY报告显示AGL1侵染后48小时（48 hpi）叶片出现明显红色，并持续至168 hpi；UV-GFP在48 hpi可见、84 hpi达峰、120 hpi减弱；GV3101无可见红色。结论为AGL1可高效介导银杏叶片瞬时转化。
2.2. Optimization of leaf transformation efficiency：以显示红色叶片比例计算转化效率，优化OD₆₀₀、pH、DTT和苗龄。OD₆₀₀=0.6时效率最高（61%）；pH 5.8优于6.8；5 mM DTT在OD₆₀₀=0.6和1.0时分别达72%和44%，优于1 mM和10 mM；40天苗效率最高（56%），20天和60天分别为22%和11%。最佳组合为AGL1、OD₆₀₀=0.6、40天苗、pH 5.8加5 mM DTT。
2.3. Application of the transient system for functional validation of key flavonoid structural genes：将Gb_01811和Gb_06949分别插入pACT2::FGFP并瞬时过表达，总类黄酮含量分别增加15.6%和24.0%，验证了结构基因功能及平台可靠性。
2.4. Identification and characterization of the flavonoid-regulating transcription factor GbMYB123：系统发育分析显示Gb_22883与拟南芥AtMYB123最相似，命名为GbMYB123；其含保守R2和R3 DNA结合结构域；启动子含激素、逆境、光响应等顺式元件；在芽和茎中表达较高；亚细胞定位在拟南芥、杨树和本氏烟草DAPI染色实验中显示定位于细胞膜和细胞核。
2.5. Heterologous and endogenous validations of GbMYB123：银杏叶片瞬时过表达使GbMYB123表达提高3.24倍，总类黄酮增加71.39%；拟南芥稳定过表达总类黄酮较野生型高50.9%；84K杨稳定过表达叶片出现红色色素，总类黄酮高于野生型且株高增加；VIGS沉默使总类黄酮由18.0 mg/g降至8.54 mg/g，降幅超过52%，并出现矮化表型；银杏愈伤过表达亦提高总类黄酮。结论为GbMYB123正调控类黄酮积累。
2.6. High-throughput identification of GbMYB123 downstream targets using the leaf transient expression platform：对GBMYB123过表达和空载叶片进行RNA-seq，主成分分析（PCA）显示组间分离良好；鉴定929个DEGs，KEGG富集于氨基糖和核苷酸糖代谢、植物激素信号转导、苯丙烷生物合成和类黄酮生物合成等通路；类黄酮途径19个DEGs多数上调，包括查耳酮异构酶（CHI）、查耳酮合酶（CHS）、羟基肉桂酰转移酶（HCT）、咖啡酰辅酶A O-甲基转移酶（CCoAOMT）、黄烷酮3-羟化酶（F3H）、类黄酮3′-羟化酶（F3′H）、黄酮醇合酶（FLS）、二氢黄酮醇4-还原酶（DFR）和无色花青素双加氧酶（LDOX）；RT–qPCR验证GbCHS、GbCCoAOMT和GbDFR在愈伤过表达中上调、在VIGS沉默中下调，与RNA-seq一致。结论为该平台可用于高通量鉴定下游靶基因。

讨论与结论：讨论部分指出，AGL1因具C58染色体背景和pTiBo542高毒力衍生质粒，T-DNA转移能力较高且组织毒性较低；DTT作为巯基还原剂可将氧化醌还原为二酚并清除活性氧，维持还原微环境，减少褐变并保护农杆菌；40天苗兼顾侵染易感性和组织韧性；同源叶片系统可避免裸子植物与被子植物异源差异；GbMYB123结果与稳定转化和VIGS验证一致；该系统可在侵染后4天采集叶片进行RNA-seq，快速获得929个DEGs和19个候选靶基因，并兼容共免疫沉淀、染色质免疫沉淀测序和液相色谱–质谱等后续分析。研究结论（翻译）：研究人员得出结论，基于RUBY的瞬时转化体系为银杏基因功能分析提供了高效平台，并可能促进其他难转化木本物种的转化研究。