《International Journal of Biological Macromolecules》：Transcription factor WRKY53 transcriptionally activates sensitive to proton rhizotoxicity 1 to promote C-repeat binding factors 1 and 3 mediated chilling tolerance in apple
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•蛋白质组学鉴定出MdSTOP1为一种冷害响应苹果蛋白。•MdSTOP1结合并激活MdCBF1和MdCBF3启动子。•MdWRKY53通过W-box特异性蛋白-DNA结合激活MdSTOP1。•MdWRKY53-MdSTOP1-MdCBF1/3模块增强苹果冷害耐受性。引言低温是
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蛋白质组学鉴定出MdSTOP1为一种冷害响应苹果蛋白。
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MdSTOP1结合并激活MdCBF1和MdCBF3启动子。
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MdWRKY53通过W-box特异性蛋白-DNA结合激活MdSTOP1。
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MdWRKY53-MdSTOP1-MdCBF1/3模块增强苹果冷害耐受性。
引言
低温是影响植物生长、地理分布和作物产量的主要环境限制因子[1]，[2]，[3]。在苹果（Malus domestica）中，冷害与季节生长周期密切相关。树木在秋季获得抗寒性，通过休眠维持越冬组织，然后在春季芽恢复生长时逐渐失去这种保护。这种发育节律使苹果在去驯化过程中尤其容易受到突发降温的影响，此时展开的芽、幼叶和生殖组织对冻害的耐受能力有限。在这些阶段的冷胁迫会损害芽存活、早期新梢生长、坐果，并最终影响果园产量。在细胞水平上，低温（LT）会干扰膜稳定性、光合电子传递、渗透平衡和氧化还原稳态，导致光抑制、电解质渗漏、脂质过氧化和活性氧（ROS）过度积累。因此，苹果依赖于协调的保护性应答，包括膜重塑、抗氧化激活、渗透调节物质积累、钙信号传导、激素交叉对话和转录重编程[2]，[3]。因此，苹果的抗寒性应被理解为一种动态生理状态，受发育时期、组织敏感性和激活多种保护通路的能力所塑造[4]，[5]，[6]，[7]，[8]。
在调控冷适应的转录系统中，CBF/DREB1-COR通路仍然是研究最为深入的模块之一[9]，[10]，[11]，[12]。在该通路中，低温激活CBF/DREB1转录因子，这些转录因子随后调控COR基因以及与耐冻性、渗透保护、抗氧化防御和膜稳定相关的下游保护程序[9]，[10]，[11]，[12]。然而，CBF通路并非一个自包含的回路。近期研究表明，CBF的激活受上游转录因子、蛋白稳定性调控、光信号和昼夜节律线索、激素信号、染色质状态及非编码RNA的影响[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，[19]。尽管CBF信号的下游输出已被充分表征，但激活CBF基因的上游信号和转录调控因子似乎在不同物种、组织和冷胁迫条件下存在差异。这种差异在木本多年生植物中尤为重要，因为冷响应必须与休眠维持、芽存活、光合恢复以及防止过早恢复生长相协调[4]，[5]，[6]，[7]，[8]。
SENSITIVE TO PROTON RHIZOTOXICITY1（STOP1）及STOP1样蛋白是一类C2H2锌指转录因子，最初以其在铝抗性、质子耐受和pH稳态中的作用而知名[20]，[21]。在酸性土壤中，STOP1激活参与有机酸转运、铝解毒、根系生长和细胞pH调节的基因[20]，[21]。近期研究还表明，STOP1活性受磷酸化、蛋白稳定性、氧化还原状态及相互作用转录伙伴的影响[22]，[23]。这些研究将STOP蛋白置于酸土适应的中心位置。然而，这一观点可能过于狭隘。使STOP蛋白能在酸胁迫中发挥功能的那些特征——核定位、C2H2锌指DNA结合以及胁迫响应基因的调控——也使它们成为其他胁迫通路中可能的候选因子。这一可能性得到了最近在水林草莓中的一项研究的支持，该研究表明FvSTOP1可正向调控果实中花青素的积累[24]。由于花青素通过与ROS清除、光保护及胁迫相关代谢调节广泛关联，从而增强抗寒性，这一发现为STOP1样蛋白在冷适应中可能发挥的作用提供了间接但有趣的证据。STOP家族成员是否能够被招募到低温信号通路中，尤其是在木本水果作物中，仍然很大程度上未被探索。这一空白尤为引人注目，因为冷胁迫和酸胁迫源于不同的环境触发因素，但共享多种细胞后果，包括膜损伤、ROS积累、代谢调整和广泛的转录重塑[25]，[26]，[27]，[28]，[29]，[30]，[31]，[32]。
WRKY转录因子为冷胁迫调控增添了另一层特异性[33]，[34]。WRKY蛋白通常识别W-box元件，并参与多种胁迫响应，包括冷、干旱、盐胁迫、氧化胁迫和激素信号传导[33]，[34]。近期研究表明，WRKY蛋白很少充当简单的开/关开关。OsWRKY53在水稻抽穗期通过精细调节花药中的赤霉素水平来负向调控抗寒性，而茶树中的CsWRKY29和大果马蹄荷（Michelia crassipes）中的McWRKY43则与增强的耐冻或抗寒性相关[35]。受独脚金内酯响应的WRKY41也可以通过激活CBF/DREB1基因促进耐冻性，将激素信号与冷响应转录级联联系起来[19]。这些对比示例表明，WRKY的功能在很大程度上取决于启动子环境、发育阶段和物种特异性调控网络。因此，鉴定出一个WRKY因子仅是第一步；更具信息量的是，它在冷胁迫下识别哪个启动子，以及该启动子选择是否与已知的冷响应通路相连。
在本研究中，低温蛋白质组学分析使MdSTOP1作为冷害响应的STOP家族蛋白引起了我们的关注。STOP蛋白通常在酸土适应的背景下被讨论，而它们在冷害响应中的作用，尤其是在木本水果作物中的角色，仍然很大程度上未被探索。这一对比促使我们提出疑问：MdSTOP1仅仅是一个冷害响应蛋白，还是它能够被纳入支持苹果抗冷害的转录网络中？因此，我们以MdSTOP1为切入点，探索了一条先前未被认识的将STOP家族蛋白与苹果冷适应联系起来的调控通路。
章节摘要
植物材料和生长条件
本研究使用的植物材料包括'GL-3'苹果植株（'GL-3'，源自'Gala'的优良品系，被广泛用作苹果稳定遗传转化的合适基因型）和'Orin'苹果愈伤组织。MdSTOP1-OE（35S:MdSTOP1-eGFP）和MdSTOP1-RNAi转基因苹果植株，以及MdSTOP1-OE转基因愈伤组织，已在我们的前期工作中构建和描述[36]。苹果植株在23 °C、长日照（LD）光周期条件下（16 h光/8 h暗）培养。
蛋白质组学分析在苹果中鉴定MdSTOP1为冷害响应候选蛋白
为了鉴定与苹果冷害胁迫响应相关的蛋白，我们比较了正常温度（NT）下生长的植株与经历冷害胁迫的植株之间的蛋白积累概况（补充表S1）。蛋白质组学分析鉴定出346个差异积累蛋白，包括在冷害胁迫下丰度增加的300个蛋白和丰度降低的46个蛋白（图1a；补充图S1a）。其中，我们发现MdSTOP1（A0A498K4R0）表现出显著增加
讨论
低温是多年生水果作物面临的反复出现的限制因素，苹果必须平衡快速的胁迫保护与在季节性温度波动中的长期发育稳定性[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]。在本研究中，我们从苹果蛋白质组中鉴定出STOP家族蛋白MdSTOP1为冷害响应候选蛋白，并证明其对冷害耐受性具有正向贡献。MdSTOP1蛋白积累在冷害胁迫下增加，并且
CRediT作者贡献声明
朱玉清：撰写 – 初稿，可视化，数据整理。姚若彤：验证，软件。朱晓敏：概念化。李建军：验证。王灿灿：正式分析。赵强：调查研究。孙志娟：方法学。李少轩：资源。田一可：监督指导。郑晓东：撰写 – 审稿与编辑。王彩虹：撰写 – 审稿与编辑，资源，项目管理。
致谢
本研究受新疆人才发展基金（XJRC-2025-KJ-PY-KJLJ-053）、山东省农业研究体系基金（SDADS-06-06）和国家自然科学基金（32472717）资助。
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