纳米颗粒与间充质干细胞强化热敏壳聚糖水凝胶用于抗生素可控释放及骨再生

《International Journal of Biological Macromolecules》：Nanoparticle- and MSC-reinforced thermosensitive chitosan hydrogel for controlled antibiotic release and bone regeneration

　　

• 含介孔硅酸锌纳米粒子的温度响应型壳聚糖水凝胶。• 负载干细胞的水凝胶支持骨再生。• 增强的粗糙度、强度、生物相容性和成骨能力。• 血小板来源的微颗粒作为促进愈合的生长因子。• 负载抗生素的水凝胶可降低药物剂量。

引言

骨组织具有很强的再生能力；然而，由骨折、肿瘤、感染或先天性问题引起的大面积骨缺损往往无法自发愈合，需要进行移植手术[1]、[2]。这种漫长的愈合过程在全球范围内构成了重大挑战，尤其对于需要快速康复的老年人和运动员而言。传统的自体移植、同种异体移植和异种移植已得到广泛应用，但存在严重局限性，包括手术并发症、供体短缺、免疫原性、疾病传播风险以及生物相容性差等问题[3]、[4]。这些挑战促使通过骨组织工程（BTE）开发合成替代方案，该方法将细胞、生物材料和生物因子相结合，以创建人工骨修复组织。BTE具有感染风险低、生物相容性优异和可修饰性高等优势[5]，旨在通过产生能够利用患者自身细胞再生的植入物来超越传统移植[6]。

水凝胶是一种含水量高的三维聚合物网络，在生物医学领域引起了广泛关注，包括组织植入物、三维细胞培养、药物递送和伤口愈合等应用。其理化性质与软组织和细胞外基质（ECM）非常相似[7]，使其成为支持细胞功能的理想材料[8]。在骨移植中，水凝胶由于其亲水性、柔韧性、可生物降解性和可注射性，特别适合用于低负荷区域[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。水凝胶可由纤维素、胶原蛋白、海藻酸钠等天然聚合物或聚乙烯醇（PVA）和聚乙二醇（PEG）等合成聚合物制成[14]。

在天然聚合物中，壳聚糖（CS）因其生物相容性、可生物降解性、低免疫原性以及有利的降解产物而脱颖而出[15]、[16]。壳聚糖来源于甲壳类动物的外壳，其正电荷和亲水性促进细胞粘附、增殖和金属离子的螯合[17]、[18]、[19]、[20]。壳聚糖有效地模拟了骨和软骨细胞外基质中的糖胺聚糖（GAGs）[21]，支持成骨细胞附着、骨基质形成和骨传导性[22]、[23]。壳聚糖质子化的氨基与带负电荷的细胞外基质（ECM）组分之间发生静电相互作用，促进成骨细胞附着。此外，壳聚糖水凝胶可以激活BMP-2/Smad和Wnt/β-catenin通路，这些通路上调碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）和骨桥蛋白（OPN）等成骨标志物，增强矿物质沉积和骨形成。其高孔隙率还支持血管长入，而可生物降解性则允许逐渐被新骨组织替代[24]。然而，壳聚糖的机械弱点通常通过纯化、交联或与合成聚合物混合来解决[25]、[26]、[27]。通过掺杂硅酸盐、锌和磷等金属氧化物可以增强壳聚糖支架的性能。这些添加剂通过促进羟基磷灰石的形成，提高生物活性、生物相容性和与骨组织的整合[28]，从而增强骨传导、骨整合、骨诱导和血管化[29]、[30]。

硅（Si）是一种重要的微量元素，在体内形成二氧化硅（硅石）。膳食中的二氧化硅可提高骨矿密度[28]、[31]，而在体内，硅基材料降解为无毒的硅酸盐离子，可调节成骨作用、成骨细胞分化、胶原蛋白-I合成和血管生成等关键细胞过程[32]、[33]。硅通过模拟天然细胞外基质（ECM）的形貌、促进成骨细胞分化和提供生物活性硅酸的控释来影响矿物质沉积，从而支持骨再生[34]。硅离子通过上调VEGF支持胶原蛋白合成和血管生成[35]。同样，锌（Zn）对骨细胞生长和结构至关重要，可刺激成骨细胞生成（例如通过上调RUNX2）、激活成骨通路（如MAPK信号传导）以及通过诱导凋亡和调节RANKL/RANK/OPG轴来抑制破骨细胞生成[36]、[37]。锌作为碱性磷酸酶（ALP）等酶的辅因子，对骨矿化必不可少[38]。含锌生物材料已被证明可以加速骨再生并提高ALP活性[39]、[40]。锌缺乏与骨缺损和生长异常有关[41]、[42]。此外，锌具有抗菌特性，有助于防止与骨植入物相关的感染[43]、[44]。介孔材料，如介孔硅酸锌（mZS），具有高表面积，可负载抗生素等小分子以实现控释。将mZS纳入壳聚糖水凝胶中可增强孔隙率、降解速率和生物矿化，进一步支持骨组织修复[45]、[46]、[47]。

含有介孔硅酸锌的生物复合支架可通过冷冻干燥制备，或制备为热敏性水凝胶。冷冻干燥产生预成型形状，可能不适合不规则骨缺损，而热敏性水凝胶在室温下保持液态，但在体温下转变为固态或凝胶状形式，以适应缺损几何形状。基于壳聚糖的热敏性水凝胶通常通过添加β-甘油磷酸钠（β-GP）形成，这是一种无毒磷酸盐，可交联壳聚糖并提高其刚性。β-GP还促进成骨作用，尤其是在骨髓基质细胞中[48]、[49]。在室温下，壳聚糖/β-GP混合物呈流体状，但加热可触发壳聚糖氨基与β-GP磷酸基之间的质子交换，形成温度响应性凝胶[19]、[50]，产生无需移除手术的稳定支架[51]。

这些温度响应性水凝胶为基于干细胞的组织工程提供了极佳平台。小鼠胚胎成纤维细胞（C3H/10 T1/2），类似于间充质干细胞（MSCs）[52]，可通过激活BMP、TGF-β、Wnt和Notch通路分化为成骨细胞，并在动物模型中促进骨愈合[53]、[54]。除了分化之外，小鼠胚胎成纤维细胞系还分泌外泌体和细胞因子，调节炎症、促进血管生成并招募内源性祖细胞。其免疫调节能力还可防止过度炎症，有利于稳定的骨痂形成和骨重塑[55]。

由于这些细胞生长缓慢，将生长因子如胰岛素样生长因子、血小板来源的微颗粒（PMPs）、血管内皮生长因子（VEGF）和骨形态发生蛋白（BMPs）纳入水凝胶中对于刺激细胞活性、增强再生和改善植入物整合至关重要。PMPs激活间充质细胞中的PI3K/Akt、ERK1/2和Src激酶通路，增强细胞迁移、血管化和成骨细胞募集。通过促进局部新生血管形成，PMPs改善了缺损部位的氧气和营养供应，间接加速骨形成。此外，PMPs的货物调控免疫反应和破骨细胞活性，创造促再生微环境[56]。然而，血小板来源的微颗粒（PMPs）在骨再生方面相比传统单一生长因子如BMP-2和VEGF具有几个明显优势。与通过有限通路作用的重组合生长因子不同，PMPs携带复杂的生物活性分子货物——包括生长因子、细胞因子、粘附蛋白和调控性microRNAs——以更生理化的方式协同调节血管生成、成骨作用和祖细胞募集[57]。作为自体且细胞来源的，PMPs最大限度地减少免疫原性风险，更准确地复制自然创面愈合微环境[58]。此外，PMPs通过微颗粒-细胞信号传导和货物转运增强干细胞归巢和通讯，这是单独应用BMP-2或VEGF所不具备的效果[59]。另外，PMPs提供了一种经济安全且更优的替代方案，避免了重组蛋白递送相关的高剂量并发症。总体而言，PMPs作为一个多因子自体信号系统，在骨修复过程中更有效地协调血管生成和成骨的耦联过程。

术后伤口部位由于剃毛和皮肤暴露而易受细菌感染。为防止感染，通常会使用抗生素，但长期使用或高剂量使用可能导致耐药性和全身性副作用。为此，我们利用水凝胶固有的抗菌特性和多孔结构，负载含抗生素的纳米粒子，提供局部药物递送并降低感染风险。在骨修复背景下，抗生素可通过多种特定的生物学机制影响愈合。首先，消除骨折或缺损部位的细菌污染或感染，去除了骨再生的主要障碍。其次，通过创造有利的无菌环境，抗生素使间充质干细胞和成骨细胞恢复其正常功能：增殖、沿成骨谱系分化和基质矿化[60]。总体而言，抗生素参与骨修复的有效机制不仅仅是抗菌作用——而是消除感染对成骨作用的抑制性影响、恢复允许性微环境以及避免抗生素对成骨细胞的细胞毒性。

基于这些组分的优势特性，本研究提出了一种可注射的热敏性水凝胶系统（mZS/CS/β-GP），结合了介孔硅酸锌纳米粒子、壳聚糖、β-甘油磷酸钠、小鼠胚胎成纤维细胞系（C3H/10 T1/2）、血小板来源的微颗粒（PMP）和负载抗生素的纳米粒子，用于骨缺损修复。体外评估了凝胶化时间、孔隙率、机械强度、表面形貌和抗菌活性。通过成骨细胞增殖、细胞毒性、活力和形态学检测评估了生物相容性。通过茜素红染色测试了骨再生能力。在体内，通过X射线成像和组织学检查验证了在鼠胫骨上通过微钻创建的关键尺寸节段骨缺损的骨再生情况。手术部位红肿的消退证实了有效的局部抗生素释放和感染控制。因此，这种组合为治疗大面积骨缺损提供了一种有前景的替代方案，能够实现更快的愈合并减少术后感染，且不会带来传统移植相关的并发症。整个实验方案已在图形摘要部分以示意图形式展示。

材料片段

材料

壳聚糖（CS）（Sigma Aldrich，美国），β-甘油磷酸钠（β-GP）（Sigma Aldrich，美国），正硅酸四乙酯（TEOS）（Sigma Aldrich，美国），Pluronic F-127（Sigma Aldrich，美国），醋酸锌（Fisher Scientific，美国），氢氧化钠（NaOH）（Qualigens，印度），十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）（SRL，印度），玫瑰红染料（RB）（SRL，印度），结晶紫（CV）（SRL，印度）。MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物]（SRL，

mZS纳米粒子表征

合成纳米粒子的水动力尺寸为1423.45 ± 222.425 nm（图1A，S1A），泽塔电位为?24.025 ± 0.8955 mV（图1B，S1 B）。透射电子显微镜图像显示了长度为1480.17 ± 342.17 nm、宽度为71.40 ± 38.78 nm的锌棒状结构，包裹着具有2.91 ± 1.03 nm孔径的硅片，即介孔（图1C，S1C）。合成mZS纳米复合材料的结晶度已通过选区电子

结论

本研究涉及开发用不同浓度mZS增强的热敏性壳聚糖水凝胶。含有β-GP和mZS的水凝胶具有较短的凝胶化时间和较高的孔隙率，促进了良好的吸水能力，支持细胞和组织生长。独特的二维结构和大的表面与体积比为水凝胶提供了机械支撑。10%mZS/CS水凝胶组合组显示出更高的抗菌

CRediT作者贡献声明

Farzana Naushin：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，可视化，验证，软件，方法论，调查研究，形式化分析，数据管理，概念化。Shaikh Nisar Ali：写作 – 原始草稿，方法论，调查研究，数据管理，概念化。Nitin Yadav：软件，方法论，形式化分析，数据管理。Virander Singh Chauhan：可视化，验证，监督，资源。Shyamal Kumar Kundu：形式化分析。Nibedita Lenka：

生成式AI和AI辅助技术写作过程声明

在本作品的准备过程中，作者使用了[ChatGPT-3.5版本]来协助[改写某些句子]。在使用该工具后，所有内容由作者仔细审阅和编辑，作者对出版物的最终内容承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由印度政府科学与工程研究委员会（SERB）资助（文件编号：PDF/2017/002057），并获得印度科学与工业研究理事会（CSIR）[资助编号：09/263(1212)/2019-EMR-I]和大学拨款委员会（教员重新注入计划）的财务支持。作者衷心感谢印度尼赫鲁大学（JNU）的Dinesh Yadav博士在动物实验期间提供的宝贵指导。

Farzana Naushin | Shaikh Nisar Ali | Nitin Yadav | Virander Singh Chauhan | Shyamal Kumar Kundu | Nibedita Lenka | Jaydeep Bhattacharya