《International Journal of Biological Macromolecules》：A nuclease-associated short pAgo system from
Pleomorphomonas koreensis with dual DNA and RNA collateral activity
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•Pko-SPARDA（来自Pleomorphomonas koreensis的一个短pAgo系统）能够切割多种核酸底物，包括ssDNA、dsDNA和RNA。•我们对Pko-SPARDA的体外生化性质进行了系统研究。•我们观察到，引导RNA的5'-磷酸化普遍增强了Pko-SP
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Pko-SPARDA（来自Pleomorphomonas koreensis的一个短pAgo系统）能够切割多种核酸底物，包括ssDNA、dsDNA和RNA。
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我们对Pko-SPARDA的体外生化性质进行了系统研究。
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我们观察到，引导RNA的5'-磷酸化普遍增强了Pko-SPARDA的反式切割活性。
引言
Argonaute（Ago）蛋白最初被鉴定为RNA干扰（RNAi）的核心效应因子，其中它们利用5'-磷酸化的小RNA识别互补的RNA转录本[1]。后续研究表明，Ago蛋白在原核生物中也很广泛。与主要靶向RNA的真核Ago蛋白（eAgos）不同，大多数原核Ago蛋白（pAgos）利用核酸引导序列，主要是DNA，来识别外来遗传元件并参与多种生物过程，包括抵御入侵核酸和同源重组[2]，[3]，[4]。根据其结构域组成，pAgos被分为长pAgos、短pAgos和PIWI-RE蛋白（P-element induced wimpy testis，含保守R（精氨酸）和E（谷氨酸）残基）[1]。长pAgos与eAgos共享保守的架构，由N（N-terminal）、PAZ（PIWI-Argonaute-Zwille）、MID（Middle）和PIWI结构域组成[5]。PAZ和MID结构域负责引导序列结合，而靶标切割由PIWI结构域内的催化四联体催化[6]。长pAgos可进一步分为长-A和长-B亚族（图1）。长-A pAgos通常具有内切核酸酶活性，而长-B pAgos缺乏保守的催化四联体，因此依赖相关效应蛋白介导核酸降解和抗病毒防御（图1）[7]。相比之下，短pAgos主要由MID结构域和催化非活性的PIWI结构域组成。这些蛋白通常与含APAZ（PAZ类似物）的伙伴结合，形成多蛋白复合物，以保护细胞免受外来遗传元件的侵害[1]，[8]，[9]。
系统发育上，短pAgos被分为四个主要进化支，分别命名为S1A、S1B、S2A和S2B[10]。在S1A和S1B进化支中，APAZ结构域与沉默信息调节因子2（SIR2）结构域融合，而在S2A进化支中，APAZ结构域与Toll/白细胞介素-1受体（TIR）结构域相连（图1）[10]，[11]。因此，这些系统分别被称为SPARSA（Short Prokaryotic Argonaute SIR2-APAZ system）和SPARTA（Short Prokaryotic Argonaute TIR-APAZ system）[12]。先前的研究表明，SPARSA和SPARTA均具有NADase活性，并在识别引导RNA（gRNA）编程的靶DNA（tDNA）时触发NAD+耗竭，从而介导细胞防御反应[11]，[13]。
S2B进化支成员表现出更多样性，其APAZ蛋白与多种效应结构域融合，包括Schlafen/Alba、Mrr-like、DUF4365和RecG/DHS-like结构域[14]。例如，来自Kordia jejudonensis的短Ago系统包含与APAZ相关的Mrr-like核酸酶，既介导引导依赖的ssDNA靶标切割，也介导引导非依赖的ssDNA和dsDNA降解[15]。在这些系统中，研究最透彻的是与DUF4365（DREN）核酸酶相关的系统，统称为SPARDA（Short Prokaryotic Argonaute DREN-APAZ system）。与SPARSA和SPARTA不同，SPARDA系统主要通过核酸降解发挥作用。当gRNA识别同源靶标时，SPARDA复合物被激活并诱导核酸的非特异性切割[12]。这种活性已在来自Thermocrispum municipale（Tmu-SPARDA）、Novosphingopyxis baekryungensis（Nba-SPARDA）、Cupriavidus metallidurans（Cme-SPARDA）和Xanthobacter autotrophicus（Xau-SPARDA）的SPARDA系统中得到报道[16]，[17]，[18]。然而，大多数短pAgo系统的功能多样性和分子机制仍知之甚少。
在本研究中，我们表征了一个此前未被研究的来自Pleomorphomonas koreensis（Pko-SPARDA）的SPARDA系统。我们证明，小RNA引导的ssDNA靶标的结合激活了该复合物并触发了ssDNA、dsDNA和RNA的非特异性降解，表明其具有极为广泛的底物谱。我们还发现5'磷酸化可以增强Pko-SPARDA活性，扩大了可用引导核酸序列的范围。此外，我们系统地研究了Pko-SPARDA的生化性质，为短pAgo介导的防御系统的功能多样性提供了新的见解。
章节摘要
SPARDA的克隆、表达和纯化
PkoAgo基因（GenBank登录号：WP_026782277.1）及其相邻蛋白DREN-APAZ（PkoRE）（GenBank登录号：WP_026782276.1）由清科生物科技有限公司克隆至pETDuet载体中两个T7启动子下游，N端6×His标签融合至PkoRE。编码Pko-SPARDA复合物的质粒转化至Escherichia coli BL21（DE3）细胞（清科）。转化体在添加100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中37°C培养至OD???为
Pko-SPARDA在RNA引导的靶DNA识别后非特异性降解DNA
Pko-SPARDA系统由短Argonaute蛋白PkoAgo及其相关DUF4365-APAZ效应蛋白PkoRE组成。系统发育分析将PkoAgo归类为短pAgos的S2B进化支（图S1A），其最接近的已表征同源物为NbaAgo，氨基酸序列同一性为74.0%（图S1B）。为研究其生化活性，将PkoAgo和PkoRE在Escherichia coli BL21(DE3)中共表达，由pETDuet载体中两个T7启动子控制（图。
讨论
Argonaute蛋白构成多样化的核酸引导防御系统家族，广泛分布于真核和原核生物中。迄今为止，大多数机制和生物技术研究集中在长pAgos上，包括嗜热Ago如PfAgo和TtAgo、中温Ago如KmAgo，以及偏好RNA的Ago如HrAgo和MbpAgo[5]，[19]，[22]，[27]，[28]，[29]。这些蛋白通常利用引导核酸识别互补靶标并
CRediT作者贡献声明
Zhizhao Chen（陈志朝）：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿撰写，验证，软件，形式分析，数据整理。Na Yu（于娜）：验证，软件，调查，数据整理。Xiaolan Yu（于晓岚）：资源，资金获取。Wenqiang Li（李文强）：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿撰写，软件，资金获取，概念构思。Longyu Wang（王龙雨）：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿撰写，软件，资金获取。Lixin Ma（马立新）：监督，资源，项目管理，
资金支持
本工作得到国家自然科学基金委员会（32400513）、湖北省博士后项目（2024HBBHCXA002）、武汉市自然科学基金（2024040701010046）、湖北省科技创新计划项目（2024BCA001）、湖北省科技计划基础研究平台项目（2025CSA129）、武汉市科技项目（2023020302020573）、科技项目的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。
陈志朝|于娜|于晓岚|李文强|王龙雨|马立新
