《Hearing Research》：Development of a Noninvasive Video-Oculography Setup for Determining VOR Presence in a Severe Vestibular Impairment Mouse Model
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用于VOR检测的无手术小鼠固定可改善动物福利与可重复性。该装置能够对严重前庭损伤小鼠模型中VOR的存在或缺失进行二元分类。轻度功能障碍模型中的定量增益（gain）与相位（phase）分析仍有待验证。VOR反应缺失与前庭损伤小鼠壶腹嵴（cristae）毛细胞严重
用于VOR检测的无手术小鼠固定可改善动物福利与可重复性。该装置能够对严重前庭损伤小鼠模型中VOR的存在或缺失进行二元分类。轻度功能障碍模型中的定量增益（gain）与相位（phase）分析仍有待验证。VOR反应缺失与前庭损伤小鼠壶腹嵴（cristae）毛细胞严重丢失相一致。
研究背景：前庭功能障碍可累及内耳平衡系统，影响头动感知、平衡与空间定向，并可伴随眩晕、头晕、失衡和凝视不稳等表现，亦可影响注意、记忆、处理速度和执行功能。其病因涉及遗传、环境、耳毒性药物、感染和衰老等，症状可为急性或慢性并显著影响生活质量。为在受控条件下研究前庭功能障碍的运动与认知后果，临床前啮齿动物模型被广泛使用。传统前庭功能评估包括死后形态学、行为学及前庭感觉输出分析；行为学依赖观察者主观判断，而前庭感觉输出可提供客观定量指标。前庭眼反射（VOR，vestibulo-ocular reflex）是前庭功能的关键指标，反映前庭与眼动系统的神经协调，可在头动时通过前庭驱动的眼动稳定凝视。传统小鼠代偿性眼动评估采用巩膜线圈或视频眼动描记（VOG，video-oculography）；巩膜线圈精度高但需在角膜表面手术植入线圈，侵入性强；VOG无需植入或接触眼，具有较高时间分辨率。然而，常规VOR装置常需通过颅骨植入金属板实现头固定，以便准确追踪瞳孔，从动物福利、时间效率和实验实用性看并不理想，且目前缺乏标准化的小鼠VOR评估装置。因此，研究人员开发并优化非侵入性头固定VOR装置，并在严重前庭损伤小鼠模型中验证其检测VOR存在性的能力，以提供可重复且更符合福利要求的手术固定替代方案。
研究人员在CD-1 Swiss小鼠中通过口服烯丙腈（allylnitrile）诱导严重前庭功能障碍，并以玉米油对照，比较VOR、行为学前庭测试、听力测试及壶腹嵴毛细胞计数。研究结论表明，该无手术固定VOR装置可可靠区分前庭功能正常小鼠与烯丙腈诱导的严重前庭损伤小鼠；对照小鼠表现稳健且可重复的VOR反应，而处理后小鼠VOR反应几乎缺失，并与广泛前庭毛细胞丢失一致。该研究的意义在于为严重前庭损伤提供非侵入性、二元化的VOR检测手段，改善动物福利与实验可重复性，并为后续定量前庭表型分析奠定基础。
关键技术方法：使用约3月龄CD-1 Swiss小鼠19只，其中12只接受烯丙腈1.25 mmol/kg灌胃、7只接受玉米油；动物原始繁殖对来自Charles River Laboratory，于University of Antwerp繁育，伦理批准号2023-43。采用3D打印无手术固定装置，配合Pupil-CR（pupil–corneal reflection，瞳孔-角膜反射）VOG追踪与手动转台正弦旋转；以VDI（vestibular deficit index，前庭缺陷指数）和游泳测试评估行为；用ABR（auditory brainstem response，听性脑干反应）和DPOAE（distortion product otoacoustic emissions，畸变产物耳声发射）评估听力；用免疫荧光计数壶腹嵴毛细胞。
3.1 非侵入性VOR装置优化：通过基线、1周、2周和8周的逐步比较，研究人员发现早期仅用瞳孔追踪易受头和相机运动伪影影响，记录不可靠；引入Pupil-CR追踪并进一步稳定相机系统后，分析从噪声较大的振幅估计转为稳健的VOR存在/缺失二元分类，最终仅第8周完全优化装置获得的数据纳入横断面比较。
3.2 VOR装置可区分严重前庭损伤与对照小鼠：通过第8周Pupil-CR追踪，在10°、1.67 Hz条件下，20%对照小鼠可检测到VOR，处理组无动物出现VOR；在2 Hz、10°条件下，多数对照小鼠有VOR；在20°、1.67 Hz条件下，80%对照小鼠有VOR而处理组均无；仅在20°、2 Hz最强刺激下，9只处理小鼠中1只（11.11%）出现VOR，但反应明显弱于对照。由于处理组几乎无可用VOR信号，研究人员未计算增益和相位；手动转台的周期变异系数（CV，coefficient of variation）为振幅4.5%、峰速度7.5%。
3.3 烯丙腈诱导前庭壶腹嵴毛细胞丢失：通过免疫荧光染色并分别计数壶腹嵴中央和外周区域毛细胞，处理组中央区（p=0.0114）和外周区（p=0.0112）毛细胞数均显著少于对照组，提示烯丙腈造成壶腹嵴广泛耳毒性损伤。
3.4 行为学前庭测试支持VOR结果：通过线性混合模型（LMM，linear mixed model）分析VDI，发现组别、时间及组别×时间交互作用均显著（p值均小于0.0001），处理组平均较对照高13.64分，性别主效应不显著（p=0.5228）；处理组从第1周起VDI显著升高并持续至第8周。游泳测试中，处理组从第1周起出现严重游泳障碍并持续至第8周，而对照大多正常。个体层面，可检测到VOR的动物VDI低于无VOR动物（p=0.0021）；6只有VOR动物中5只游泳正常，而8只无VOR动物均表现严重游泳障碍（p=0.003），表明VOR结果与行为学评估一致。
3.5 烯丙腈暴露后ABR阈值频率特异性升高而DPOAE未变：通过ABR和DPOAE评估，处理组在4、8、16 kHz出现显著听阈升高，对照阈值稳定；DPOAE在各频率和时间点无显著组间差异，但基线DPOAE阈值已较高。MYO7A（myosin-7A）全装染色显示处理组Corti器内、外毛细胞完全丢失，对照动物毛细胞部分但明显保留；该染色仅作为定性示例。
讨论部分总结：该研究关键目标是评估新开发非侵入性装置在严重前庭损伤小鼠模型中检测VOR存在性的能力。结果表明该系统可可靠区分对照与烯丙腈诱导前庭损伤小鼠，且VOR结果得到行为学测试独立支持；听觉评估显示烯丙腈亦影响耳蜗功能。关于增益和相位，传统上二者是定量VOR指标，但本模型前庭损伤严重、VOR几乎缺失，无法进行有意义的增益和相位定量；这一限制主要源于模型生物学严重性，而非记录系统固有缺陷，对照动物在120 Hz Pupil-CR追踪下可稳定记录，未来需在部分或进行性前庭功能障碍模型中验证定量能力。传统颅骨植入式头固定存在感染、炎症、颅骨损伤、术后疼痛及应激等缺点，非侵入性固定可减少动物负担，但烯丙腈模型本身仍存在死亡率；习惯化仍对减少应激和稳定数据十分重要。未来改进包括使用色素较深的小鼠品系提高瞳孔对比、采用更小更轻的相机、使用电机控制转台提高刺激可重复性，并探索短时高加速度旋转刺激。
研究结论（译）：本研究所建立的非侵入性VOR装置是朝着更精细且以动物福利为导向的临床前前庭评估迈出的重要一步；该系统无需侵入性操作即可可靠区分前庭功能正常动物与严重前庭损伤动物。未来整合优化追踪、自动刺激递送以及表现部分前庭功能障碍的模型，将有助于确立该装置的定量能力，并可能最终将其应用从严重缺陷的二元检测扩展到广谱前庭功能障碍模型的详细前庭表型分析。
