基于多酶级联生物转化的大肠杆菌工程菌株从L-酪氨酸合成丹参素的研究

《PLOS One》：Multienzyme cascade biotransformation of L-Tyrosine to Danshensu by engineered Escherichia coli

　　

丹参素（Danshensu，DSS）是一种水溶性生物活性化合物，具有显著的抗氧化、抗炎、心脏保护和神经保护特性，广泛应用于心脑血管疾病。在本研究中，研究人员在工程化大肠杆菌（Escherichia coli）中建立了一个多酶级联系统，用于从L-酪氨酸（L-Tyrosine）合成DSS。最初共表达4-羟基苯乙酸3-单加氧酶（4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase，HpaBC）、L-氨基酸脱氨酶（L-amino acid deaminase，aadL）、葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，gdh）和D-乳酸脱氢酶（D-lactate dehydrogenase，ldhD）获得了5.1 mM的DSS。通过优化质粒拷贝数，DSS产量提高至6.53 mM。在条件优化后，菌株6的DSS产量达到8.66 mM。最终，在生物反应器中使用菌株6进行全细胞生物转化，在32小时内获得了19.47 mM的DSS。这些发现为利用天然可获得的底物L-酪氨酸规模化生物合成具有药学重要性的化合物DSS提供了有价值的见解。

论文解读：基于多酶级联生物转化的大肠杆菌工程菌株从L-酪氨酸合成丹参素

一、研究背景与目的

丹参素（Danshensu，DSS）是一种水溶性生物活性化合物，具有显著的抗氧化、抗炎、心脏保护和神经保护等多重药理作用，被广泛用于心脑血管疾病的治疗。此外，DSS还可作为前体用于合成多种高价值衍生物，如由DSS与冰片合成的丹参素冰片酯（DBZ）以及由DSS与异丙醇合成的异丙基二羟丙酸酯（IDHP），这些衍生物相比DSS具有更强的治疗效果。

目前DSS的工业化生产主要依赖从丹参（Salvia miltiorrhiza）根中提取，但该方法面临显著限制：丹参资源有限、大量使用有机溶剂、副产物多且纯化困难。传统化学合成法以苯甲醛为起始原料，涉及复杂的多步反应且立体化学控制不足。近年来，合成生物学技术快速发展，已被用于生产大量高价值的天然产物，符合现代绿色化学原则的生物技术方法成为可持续生产DSS的理想选择。

此前已有研究探索了结合生物与化学方法的催化生产路线，例如Rao等人开发的化学酶法路线，以及通过代谢工程在大肠杆菌中引入羟化酶复合体和D-乳酸脱氢酶重建DSS合成途径等。然而，现有方法仍存在底物成本高、反应步骤复杂等问题。本研究旨在利用天然易得且廉价的L-酪氨酸（L-Tyrosine）作为底物，通过构建工程化大肠杆菌菌株实现DSS的高效生物合成。

二、关键技术方法

研究人员采用的主要关键技术包括：多酶级联系统的构建，即在大肠杆菌BL21（DE3）中共表达4-羟基苯乙酸3-单加氧酶（HpaBC）、L-氨基酸脱氨酶（aadL）、D-乳酸脱氢酶（ldhD）和葡萄糖脱氢酶（gdh）四种关键酶；质粒拷贝数优化策略，通过组合不同拷贝数的表达载体（高拷贝pRSFDuet-1、中拷贝pETDuet-1、低拷贝pCDFDuet-1）来平衡通路基因的表达水平；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）用于检测各基因的相对转录水平；全细胞生物转化工艺的优化，包括诱导条件和反应条件的单因素优化实验；以及在5 L生物反应器中进行放大生产。

三、研究结果

3.1 筛选合适的异源基因构建级联反应生产DSS

研究人员选择了经随机突变和高通量筛选获得的高活性HpaB突变体（23F9-M4），以及已被证实能高效转化L-多巴（L-DOPA）为3,4-二羟基苯丙酮酸的aadL、能将3,4-二羟基苯丙酮酸还原为DSS的ldhD、以及能高效将NAD⁺转化为NADH以实现辅因子再生的gdh。由于HpaBC和ldhD具有混杂底物特异性，DSS可通过两条途径合成。研究人员构建了菌株1，在其中使用pRSFDuet-1（高拷贝）表达HpaBC和aadL，使用pETDuet-1（中拷贝）表达ldhD和gdh，经过6小时全细胞生物转化获得5.1 mM DSS。

3.2 通过平衡通路基因表达增强DSS产量

研究人员构建了7种不同质粒组合的工程菌株，并通过RT-qPCR检测各基因的相对转录水平。结果表明，菌株1中HpaBC的相对转录水平是菌株2的2.4倍，其DSS产量（5.1 mM）也显著高于菌株2（2.26 mM），表明强表达HpaBC对提高DSS产量至关重要。菌株3和菌株4的产量均低于菌株1。菌株5的产量（4.11 mM）略低于菌株1。最终，菌株6使用pRSFDuet-1（高拷贝）表达HpaBC和aadL，使用pCDFDuet-1（低拷贝）表达gdh和ldhD，其DSS产量达到6.53 mM，比菌株1提高了28.1%。菌株7的产量（6.18 mM）低于菌株6。研究表明，HpaBC催化的羟化反应可能是DSS生成的限速步骤，而gdh在低拷贝质粒上的适度表达足以满足辅因子再生的需求。

3.3 优化细菌培养条件

研究人员对菌株6的诱导条件进行了系统优化。结果显示，最佳诱导OD₆₀₀值为0.93，最佳IPTG终浓度为0.5 mM，最佳诱导温度为25℃，最佳诱导时间为12小时。随后对全细胞生物转化的反应条件进行优化，发现最适温度为35℃，此条件下DSS终浓度为8.66 mM；最适pH为7.5；最佳湿细胞重量为50 g/L。研究指出，单因素优化方法难以评估各因素间的交互作用，未来需采用多变量统计模型进一步优化。

3.4 在生物反应器中放大生产DSS

研究人员在5 L生物反应器中分别使用菌株6和菌株7进行全细胞生物转化放大实验。菌株6在32小时内从25 mM L-酪氨酸生产出19.47 mM DSS，仅有少量中间产物积累，表明HpaBC和aadL可能是限速酶。菌株7从25 mM L-酪氨酸生产出17.44 mM DSS。与以往使用葡萄糖或L-多巴作为底物的方法相比，本研究使用天然易得的L-酪氨酸作为底物，且实现了多酶级联的一锅法反应，大大简化了生产过程。

四、讨论与结论

研究人员通过共表达HpaBC、aadL、ldhD和gdh成功构建了能够将L-酪氨酸转化为DSS的工程化大肠杆菌菌株。通过优化不同拷贝数质粒与通路基因的组合，显著提高了DSS的合成效率。本研究为DSS的生产提供了新的思路，展示了利用天然易得底物通过多酶级联生物转化规模化生产具有药学重要性化合物的可行策略。