整合化学特征分析用于蜂蜜真伪鉴定与产地鉴别

《Food Chemistry》：Integrated chemical profiling for honey authentication and origin discrimination

　　

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  蜂蜜真伪鉴定与产地鉴别的一体化方法。
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  优化的HPAEC–PAD技术可实现快速、可靠的糖类谱分析。
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  糖类、有机酸和理化参数作为关键标志物。
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  PCA和PLS–DA可有效分类蜂蜜的植物来源。
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  多标志物策略可提高错标和掺假的检测能力。

引言

蜂蜜是由Apis mellifera从植物花蜜或蜜露中采集、转化并存放在蜂巢中的天然甜味剂，因其独特的口感以及营养和健康功效而自古被食用。蜂蜜的组成受地理位置、植物来源、气候和土壤条件以及养蜂管理方式等多种因素的影响。蜂蜜的主要成分是碳水化合物，约占其干重的95%。在这些碳水化合物中，单糖（果糖和葡萄糖）约占75%，而双糖（如蔗糖）和寡糖（包括三糖和四糖）则占剩余部分。除糖类外，蜂蜜还含有多种生物活性化合物，包括氨基酸、维生素、矿物质、有机酸、多酚和酶。这些化合物的浓度取决于影响蜂蜜生产的植物和环境条件。蜂蜜的生物活性成分赋予其广泛认可的健康功效，包括抗炎、抗氧化和抗菌活性，使其成为具有相当营养和功能性价值的一种食品。根据来源不同，蜂蜜可分为花蜜（花卉）蜂蜜，由开花植物的花蜜制成；以及蜜露蜂蜜，由特定植物和/或昆虫的分泌物制成，通常来自蚜科植物取食昆虫。根据来源是花蜜还是蜜露，蜂蜜的化学成分差异显著（Brar等，2023；Se等，2019；Soares等，2017；Tosun & Keles，2021；Trifkovi?等，2017；Xu等，2020）。为明确确定植物来源，蜂花粉学分析被广泛应用来评估花粉谱并鉴定蜜蜂所利用的具体花卉资源。此外，常规的理化分析（评估水分含量、自由酸度和蛋白质水平等参数）为蜂蜜的成熟度、质量和发酵易感性提供了基本指标（Santos Júnior等，2020）。

如上所述，花蜜蜂蜜和蜜露蜂蜜的糖谱差异显著，蜜露蜂蜜表现出更高的寡糖浓度和较低的单糖浓度。此外，果糖与葡萄糖的比值可作为区分不同植物来源的纯种蜂蜜的鉴别参数（Ayton等，2025；Bella等，2025）。据报道，蜜露蜂蜜中梅里佐糖、棉子糖和泛糖的含量较高。其中，梅里佐糖已被证明是蜜露蜂蜜的特征植物标志物，可占寡糖部分高达70%（Seeburger等，2020；Shaaban等，2020）。分析糖谱对于验证蜂蜜真实性和检测潜在糖类掺假物至关重要（Pita-Calvo和Vázquez，2017；Pita-Calvo和Vázquez，2018；Se等，2019；Seeburger等，2020）。

然而，蜂蜜经常被掺假，通常通过添加便宜的糖糖浆等碳水化合物成分来模拟蜂蜜的天然糖谱。如果添加的糖类表现出蜂蜜的天然糖类组成，这种欺诈行为将特别难以检测。用来自玉米、甘蔗和其他C4植物的糖浆掺假蜂蜜相对容易检测，因为它们具有不同的碳同位素特征；而用来自甜菜、稻米、小麦和菊苣等C3植物的糖浆进行掺假则更具挑战性，因为这些植物通常是蜜蜂采集花蜜的来源。对蜂蜜掺假问题的日益担忧源于天然蜂蜜的高营养价值和独特风味，使其成为欺诈行为的理想目标（Brar等，2023；Fuentes Molina等，2020；Morales等，2008；Pascual Maté等，2018；Soares等，2017；Tosun，2013；Trifkovi?等，2017）。

已开发多种分析技术用于蜂蜜真伪鉴定，每种技术侧重于不同的理化参数。元素分析仪/液相色谱–同位素比值质谱法（EA/LC–IRMS）和氢质子核磁共振（¹H NMR）光谱法可提供定性数据，指示标志物的存在，但在定量外源糖浆方面存在局限（Dong等，2016；Egido等，2024；Morales等，2008）。虽然稳定碳同位素比值分析已用于检测来自玉米或甘蔗的糖浆，但对鉴别其他糖类糖浆的掺假则无效。因此，仍然需要可靠的方法来识别和测量糖浆掺假。高效液相色谱和气相色谱–质谱法，以及HPAEC–PAD等色谱方法被广泛使用，但蜂蜜中高浓度的单糖和双糖使分析变得复杂（Amiry等，2016；Pascual-Maté等，2018；Soares等，2017）。除靶向代谢组学分析外，使用电感耦合等离子体光学发射光谱（ICP–OES）或ICP质谱（ICP–MS）和微波诱导等离子体光学发射光谱（MIP–OES）等稳健光谱技术进行多种主量元素和微量元素的测定，对于确定复杂基质的产地和环境真实性变得越来越重要（Nascimento等，2024；Santos Júnior等，2020）。最近，高分辨率质谱和蜂蜜NMR分析等技术的发展，改进了糖浆检测和掺假识别。高分子量寡糖，特别是聚合度大于7的寡糖，是检测淀粉糖浆掺假的关键标志物（Amiry等，2016；Pascual Maté等，2018；Soares等，2017）。将HPAEC–PAD与化学计量学相结合的方法可以识别掺假程度在1%到40%之间的样品，并达到高的分类准确率。由于这些多仪器方法产生大量高维数据集，多变量统计技术如主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）被常规用于降维并基于理化特征和矿物质谱评估样品间的相似性。此外，为了应对复杂掺假物带来的固有复杂性和光谱重叠问题，近期研究展示了卷积神经网络（CNNs）和深度异质集成元学习等先进机器学习算法在真实性预测中实现卓越稳健性和泛化能力的变革潜力（Minho等，2025；Nascimento等，2024；Santos Júnior等，2020）。尽管面临挑战，这些方法的持续发展对于可靠且易于获取地检测糖类掺假物、确保蜂蜜真实性和消费者保护至关重要（Chiara等，2021；Li等，2024；Schievano等，2017）。

在此背景下，靶向代谢物分析已成为蜂蜜真伪鉴定的有力工具。尽管已有大量研究调查了糖类组成、有机酸或稳定同位素比值等个体标志物，但缺乏将这些参数整合到统一化学计量框架中的综合方法。为弥补这一空白，本研究的新颖性在于这些标志物类别在单一鉴定工作流中的协同、顺序整合。具体而言，样本首先使用理化、蜂花粉学和EA–IRMS标准进行严格评估。只有满足这些严格预设条件的样本才进行HPAEC–PAD糖类谱分析、IC–CD有机酸谱分析和多变量分析（PLS–DA）。这种严格的筛选设计至关重要，因为它降低了明显的质量缺陷或C4糖类掺假被误判为天然植物变异的可能性。因此，本研究旨在建立这一综合化学计量框架作为稳健的概念验证，为靶向植物来源鉴定奠定基础，并可进一步利用更大规模、独立收集的数据集进行全球验证。

章节片段

试剂与材料

有机酸（柠檬酸、异柠檬酸、延胡索酸、马来酸、丙二酸、苹果酸、奎宁酸、琥珀酸和莽草酸）和糖类标准品（葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、蜜二糖、麦芽糖、异麦芽糖、棉子糖和芽蜜三糖）购自Supelco/Sigma–Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。硫酸（H₂SO₄）、焦磷酸钠二水合物（Na₂WO₄ × 2H₂O）和50%氢氧化钠溶液（NaOH）购自Sigma–Aldrich公司。碳稳定同位素参考标准IAEA–600，其

理化参数和蜂花粉学分析

为了更好地了解所选蜂蜜样品的质量和真实性，采用国际蜂产品委员会（IHC）推荐的方法测定理化参数（Bogdanov，2009）。电导率、自由酸度、羟甲基糠醛含量、果糖/葡萄糖和葡萄糖/水比值等质量参数对于区分真实样品与这些参数超出蜂蜜质量标准允许限值的样品至关重要（Bogdanov，2009

结论

本研究评估了一种用于蜂蜜真伪鉴定的顺序框架，该框架结合了理化筛选、蜂花粉学筛选、EA–IRMS、HPAEC–PAD糖类谱分析、IC–CD有机酸谱分析和多变量分析。该工作流旨在检查首先满足预设真实性条件的参考集中蜂蜜的植物来源鉴别，从而减少质量缺陷和潜在C4糖类掺假带来的明显混杂因素。

最清晰的

CRediT作者贡献声明

Mihajlo V. Jakanovski：撰写——初稿，可视化，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念化。Aleksandra V. Pavlovi?：调查，形式分析，数据整理。Jelena ?. Trifkovi?：撰写——审阅与编辑，监督，资源，方法论。Sandra B. ?egan：撰写——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，方法论。Du?anka M. Milojkovi?-Opsenica：撰写——审阅与编辑，监督，项目

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能被认为影响本论文中报告工作的已知的财务竞争利益或个人关系。

致谢

本研究获得了塞尔维亚共和国科学、技术开发与创新部的资金支持（合同编号：451-03-33/2026-03/200026、451-03-33/2026-03/200168、451-03-34/2026-03/200161和451-03-33/2026-03/200161）。作者确认，这项工作为联合国2030年可持续发展议程做出贡献，特别是针对目标3：良好健康与福祉，以及目标17：促进目标实现的伙伴关系。

Mihajlo V. Jakanovski|Aleksandra V. Pavlovi?|Jelena ?. Trifkovi?|Sandra B. ?egan|Du?anka M. Milojkovi?-Opsenica