《Food Chemistry》：Development and validation of an analytical method for the comprehensive profiling of tryptophan-derived compounds in pistachio (
Pistacia vera L.)
编辑推荐：
•开发了一种针对开心果中吲哚类化合物的靶向UHPLC-MS/MS方法。•优化包括超声辅助提取和脱脂步骤。•该方法针对八种色氨酸衍生生物活性代谢物进行了验证。•首次使用四种开心果品种进行了方法应用。•结果凸显了开心果作为吲哚类化合物来源的价值。引言地中海饮食的特点是高摄入水果、
• 开发了一种针对开心果中吲哚类化合物的靶向UHPLC-MS/MS方法。
• 优化包括超声辅助提取和脱脂步骤。
• 该方法针对八种色氨酸衍生生物活性代谢物进行了验证。
• 首次使用四种开心果品种进行了方法应用。
• 结果凸显了开心果作为吲哚类化合物来源的价值。
引言 地中海饮食的特点是高摄入水果、蔬菜、豆类、全谷物、坚果和特级初榨橄榄油。开心果和其他坚果的摄入有助于改善心脏健康、减少炎症并降低慢性疾病风险（Grao-Cruces等，2023）。这些好处通常与它们的健康脂肪和多酚类化合物有关（Gon?alves等，2023），而对其他化合物的潜在影响，如色氨酸、褪黑素或血清素，关注有限。色氨酸是一种必需氨基酸，在人体生理中起着根本性作用。它参与蛋白质合成，并作为血清素和褪黑素等关键分子的前体，这些分子调节情绪、食欲、睡眠和昼夜节律。由于人体无法内源性合成色氨酸，充足的膳食摄入对于正常生理功能至关重要。褪黑素是一种主要在松果体合成的神经激素，在昼夜节律和睡眠-觉醒周期的调节中起着核心作用。除其时间生物学功能外，它还表现出显著的抗氧化、免疫调节和神经保护作用，凸显了其广泛的生理相关性（Huang & Mazza，2011；Salehi等，2019）。这种化合物在动物体内内源性产生，但最近几项研究强调了其在各种植物性食物中的存在，扩大了其在哺乳动物系统之外的意义（Mu?oz-Jurado & Escribano，2024）。通常，这些化合物已在多种坚果和种子中检测到，包括核桃、杏仁和开心果，使这些食物成为增强人类健康的潜在膳食来源（Meng等，2017）。其中，开心果因相较于其他坚果含有较高的褪黑素而受到关注，表明其作为功能食品的潜力（Verde等，2022）。
褪黑素和血清素是从色氨酸合成途径衍生的吲哚类化合物，这表明该途径中的其他化合物也可能存在于开心果（和坚果）中。这些其他化合物具有重要的健康促进特性，如5-羟色氨酸（5-HTRP）、N-乙酰血清素（NACSERO）或吲哚-3-乙酸（3-IAA）。所有这些都是在发酵食品（Fernández-Cruz等，2020）、水果和蔬菜（Pranil等，2021）以及生物样本（Anesi等，2019）中被广泛研究的生物活性化合物。然而，尚无证据表明在坚果中进行了全面评估，文献仅限于血清素和褪黑素。
此外，坚果中色氨酸衍生物的析出仍然是一个复杂的问题，由于其提取和鉴定相关的挑战。一方面，开心果含有高浓度的脂肪、蛋白质和其他非极性物质，这些物质可能会干扰提取。具体来说，高脂质含量倾向于形成乳化物，使有效地分离水相和有机相变得困难。这可能导致目标分析物回收率低和结果变异性增加。另一方面，一些提高回收率的技术可包括在不同的提取步骤中，如使用有机溶剂（己烷、丙酮、氯仿）进行脱脂、超声辅助提取或使用固相萃取（SPE）进行纯化。在此背景下，选择合适的方法至关重要，以避免化合物回收率低或完全损失，从而低估其在食品中的实际浓度（Ordo?ez-Díaz等，2018）。所有这些都代表了分析挑战，由于坚果的复杂组成以及这些生物活性化合物存在的低浓度（Erland等，2016）。
传统上，HPLC方法结合荧光和紫外-可见光检测器已被广泛用于定性分析和定量分析（Huang & Mazza，2011；Verde等，2022），由于其成本较低。然而，由于检测限较高，这种定量方法在准确定量方面受到限制（Gon?alves等，2021）。此外，检测过程经常受到在其他物质存在的影响，这些物质可能在相似的波长范围内吸收，导致定量误差更大。在高背景噪声和基质干扰下，可能会限制在复杂基质（如食品，特别是富含脂质的食品如开心果）中结果的准确性（Kharbach等，2023）。与紫外-可见光检测器相比，荧光检测器的灵敏度更高，并且由于其固有荧光特性而被优选用于检测低浓度的色氨酸衍生物（Kharbach等，2023）。然而，这种天然荧光相对较弱，量子产率低，这限制了它们的灵敏度，使它们不适合使用荧光检测器直接检测（Cowgill，2022）。尽管如此，在复杂基质中使用传统技术定量褪黑素的适用性非常有限，而使用液相色谱串联质谱（LC-MS）更为适宜。由于其高灵敏度、选择性以及在微量水平上识别具有相似结构和化学性质的化合物的能力，该技术作为一种强大的替代方案出现。该方法已成功应用于发酵食品中褪黑素及相关化合物的检测，其中复杂基质需要稳健的分析方法（Fernandez-Cruz等，2016）。MS/MS检测器的使用可能克服传统LC检测器（如二极管阵列检测器或荧光检测器（FLD））的限制，特别是对于富含脂质的食品基质中的生物活性化合物如开心果，提高了目标分析物的灵敏度和准确性（Paroni等，2019）。尽管如此，现有方法需要进一步改进，以解决与坚果中提取物提取过程、高检测限和重现性相关的问题。据作者所知，关于开心果色氨酸途径化合物全面表征的文献尚未报道。
考虑到上述内容，本研究旨在评估开心果样品中色氨酸衍生物的提取过程的不同参数，并开发和验证一种UHPLC-MS/MS方法对其进行定量。随后 ，该方法被应用于来自四种不同品种的真实开心果样品。
部分片段 化学品 本研究中使用的所化学品和试剂均为分析纯或HPLC级。标准化合物（5-羟色氨酸、血清素、色胺、色氨酸、N-乙酰血清素、褪黑素、3-吲哚乙酸和N-乙酰色胺）购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），而包括甲醇和己烷在内的溶剂购自Panreac AppliChem ITW Reagents（西班牙巴塞罗那）。超纯水来自Milli-Q系统（Millipore，美国马萨诸塞州贝德福德）。储备溶液
提取程序评估 总共考虑了八种色氨酸衍生物化合物来评估从开心果中提取的方法（图2）。这些化合物是根据它们在植物褪黑素生物合成途径中的作用选定的（Fernández-Cruz等，2016）。
首先，通过比较三种溶剂（A、B和C）并评估超声辅助提取（UAE）对八种目标化合物回收率的影响，评估了提取效率。应用
结论 对色氨酸衍生物的评估涉及评估不同的提取参数，并成功验证了UHPLC-MS/MS方法。所选方法证明对于识别和定量开心果中的色氨酸衍生物化合物具有选择性、灵敏度和准确性，允许测定植物褪黑素生物合成途径中的八种化合物。该提取方法克服了由于复杂脂肪引起的干扰和低回收率问题
CRediT作者贡献声明 Isabel Velasco-Ruiz： 撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，软件，方法论，调查，形式分析，数据整理，概念化。 José Manuel Moreno-Rojas： 撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，监督，资源，资金获取，概念化。 Gema Pereira-Caro： 撰写——审阅与编辑，资源，资金获取。 José Luis Ordó?ez-Díaz： 撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，监督，方法论，
未引用参考文献 AOAC International，2012
Ordó?ez等，2018
利益冲突声明 作者声明，他们没有已知的竞争经济利益或个人关系，这些关系可能会影响本论文中报告的工作。
致谢 I. Velasco-Ruiz得到西班牙教育、文化和体育部（FPU21-01441）的支持。J.L.Ordó?ez-Díaz通过安达卢西亚自治区经济转型、工业、知识和大学部在PAIDI 2020计划下的博士后合同（POSTDOC_21_00914）获得支持。本出版物是MCIN/AEI/
10.13039/501100011033 资助的Grant EQ.C2021-007191-P的一部分，以及欧盟NextGeneration EU/PRTR的一部分。
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