LPxTG结构蛋白-信号肽融合过表达增强植物乳植杆菌C8群体感应相关功能特性、生物被膜形成及黏附能力

《Food Nutrition》：LPxTG-signal peptide overexpression enhances quorum-sensing-related functional properties of Lactiplantibacillus plantarum C8

　　

本研究采用分子对接技术筛选合适的组氨酸激酶（histidine kinase）和信号肽（signal peptide），构建含LPxTG结构蛋白和信号肽的重组菌株，并随后对重组菌株的生长特性及功能特性进行表征。通过对植物乳植杆菌C8（Lactiplantibacillus plantarum C8，L. plantarum C8）进行全基因组和蛋白质组分析，鉴定出与群体感应（quorum sensing）相关的组氨酸激酶（WP_003643155.1）、信号肽（MNFKTAAKVTVVAGASVLFLA）和LPxTG结构蛋白（WP_015640913.1）。通过同源重组和PCR扩增构建含LPxTG结构和信号肽的重组质粒，并将其转化至L. plantarum C8感受态细胞，从而在L. plantarum C8中建立LPxTG结构和信号肽的蛋白过表达系统。重组菌株中靶基因的相对表达量较野生型L. plantarum C8高5.81倍。L. plantarum C8与重组菌株共培养显著增强了生长特性、产酸能力及AI-2荧光强度。黏附试验表明，共培养的L. plantarum C8与重组菌株的自聚集能力和表面疏水性分别为69.95%和29.08%。此外，共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）结果表明，L. plantarum C8与重组菌株共培养形成的生物被膜结构密度最高、绿色荧光最强。这些发现为今后在发酵乳制品中的应用研究提供了依据。

研究背景方面，Lactiplantibacillus plantarum（L. plantarum）具有较强的环境适应性，可耐受高盐和酸性环境，在食品和医药领域具有应用前景。表面蛋白是细菌细胞壁的重要组成部分，可通过与宿主肠上皮细胞受体结合促进益生菌在肠道中的定植和生长；其中LPxTG结构蛋白是L. plantarum的重要表面蛋白，可稳定附着于细胞表面并通过黏附特性增强菌体与宿主细胞的相互作用。已有研究提示LPxTG结构蛋白的表达受群体感应（quorum sensing，QS）影响，L. plantarum的种间QS主要由LuxS/AI-2系统调控，参与胆盐耐受、抗菌功能和黏附能力等生理过程；种内QS主要依赖自诱导肽和双组分系统，影响生物被膜形成和抗菌物质合成等。组氨酸激酶（histidine kinase）是双组分系统中的关键感应元件，可感知外界环境或胞内信号并向下游响应调控转录因子传递信号；信号肽（signal peptide）则介导蛋白跨膜运输，并可能参与细菌信号网络和细胞间通讯。基于此，研究人员从L. plantarum C8的全基因组和蛋白质组中筛选QS相关组氨酸激酶、信号肽和LPxTG结构蛋白，分析组氨酸激酶与信号肽的相互作用，并构建含LPxTG结构蛋白和信号肽的重组过表达系统，以考察其对菌株生长特性和功能特性的影响，为L. plantarum的深入开发提供思路。

研究人员开展的主要关键方法包括：基于NCBI、UniProt、COG、GO和KEGG等数据库从L. plantarum C8全基因组和蛋白质组中筛选目标蛋白；采用SWISS-MODEL和I-TASSER进行同源建模，利用Discovery Studio的ZDOCK/RDOCK及GRAMM进行分子对接，并用GROMACS 2022.5开展分子动力学模拟和MM-PBSA计算；通过同源重组和PCR构建pMG36e重组质粒并电转化L. plantarum C8；采用RT-qPCR（reverse transcription quantitative PCR，逆转录定量PCR）及2^?ΔΔCt法测定表达水平；通过共培养体系检测生长、产酸、AI-2荧光、胃肠液耐受、自聚集、表面疏水性、Caco-2细胞毒性/黏附及CLSM生物被膜。菌株来源为L. plantarum C8（CGMCC No. 30504），Caco-2细胞购自Fuheng Biological Technology Co., Ltd.（上海，中国）。

研究结果如下。3.1 筛选与同源建模：通过全基因组和蛋白质组分析各鉴定出5个与QS相关的组氨酸激酶和信号肽，二者共同鉴定出WP_003643155.1和WP_015380110.1；WP_015640913.1因具有完整LPxTG细胞壁锚定基序而被选为LPxTG结构蛋白，信号肽MNFKTAAKVTVVAGASVLFLA因预测分泌潜力及在Discovery Studio和GRAMM筛选中最低对接能而被选中，并分别用SWISS-MODEL和I-TASSER完成结构建模。3.2 LPxTG结构蛋白筛选：全基因组分析共筛选出11个LPxTG结构蛋白，与NCBI数据库比对后仅WP_015640913.1完全符合LPxTG基序结构特征，故选为后续实验靶蛋白。3.3 分子对接结果分析：该信号肽在两种对接模式中的结合能分别为-37.15 kcal/mol和-27.4 kcal/mol，显示与组氨酸激酶较强结合亲和力；组氨酸激酶的ILE、PHE和TYR残基与信号肽的VAL、ALA和LEU残基间形成氢键。3.4 分子动力学结果分析：组氨酸激酶单独存在时RMSD较高且波动大，而与信号肽形成复合物后RMSD降低、波动减小；RMSF显示1000-2000、4000-5000和6000-7000区间柔性较高，2000-4000和5000-6000区间较稳定；Rg由约4.0 nm降至约3.0 nm并稳定，氢键数稳定在5-15，Gibbs自由能分布呈低能谷和聚集极小值，MM-PBSA得到ΔH=-789.59 kJ/mol、-TΔS=385.56 kJ/mol、ΔG=-404.04 kJ/mol，提示复合物具有较强热力学稳定性。3.5 PCR扩增结果：LPxTG目标基因1038 bp、信号肽目标基因60 bp、LPxTG+信号肽融合片段1098 bp、线性pMG36e质粒3610 bp，电泳条带单一清晰且与预期一致。3.6 重组表达质粒构建：通过同源重组成功构建LPxTG-pMG36e重组质粒，含LPxTG结构蛋白和信号肽基因序列、P32启动子及红霉素抗性标记。3.7 LPxTG结构蛋白基因表达水平：RT-qPCR显示空载菌靶基因表达为1.28，与L. plantarum C8无显著差异；重组菌表达为5.81，较L. plantarum C8显著上调（p < 0.001），约增加4.54倍，表明靶基因在转录水平显著上调。3.7.1 共培养条件下重组菌对L. plantarum C8组氨酸激酶和响应调控转录因子的影响：组氨酸激酶基因在空载菌为0.49、重组菌为2.41；C8+空载共培养为1.15，C8+重组共培养显著升至6.83（p < 0.001）。3.7.2 共培养体系中调控转录因子基因表达水平：空载菌为0.82、重组菌为2.20；C8+空载共培养为1.27，C8+重组共培养显著升至5.96（p < 0.001），表明信号肽增强了组氨酸激酶信号转导效率并提高下游响应调控转录因子表达。3.7.3 共培养体系生长曲线：0-2 h各实验组OD_600nm较低，2-12 h快速升高进入对数期，12-24 h趋于稳定；重组菌生长速率和终OD_600nm高于空载菌，C8+重组共培养终OD_600nm显著高于其他组。3.7.4 共培养体系产酸曲线：0-6 h各组pH快速下降，6-24 h下降趋缓；C8+重组共培养产酸效率更高，提示两菌间存在协同作用。3.7.5 共培养体系AI-2荧光强度：C8和重组菌荧光强度快速升高，空载菌升高较慢且整体较低；共培养中C8+重组荧光强度显著高于其他组，表明QS信号响应和代谢活性更强。3.7.6 共培养体系胃肠耐受实验：未处理时五组活菌数约9.10-9.14 log CFU/mL且无显著差异；胃液处理2 h后重组菌为8.07 log CFU/mL、C8+重组为8.11 log CFU/mL，显著高于其他三组（p < 0.001）；肠液处理3 h后重组菌为5.59 log CFU/mL、C8+重组为5.60 log CFU/mL，存活率显著更高。3.7.7 共培养体系自聚集能力：12 h内C8、空载菌、重组菌自聚集能力分别为42.96%、41.23%、58.41%；C8+空载为47.59%，C8+重组显著最高为69.95%。3.7.8 共培养体系表面疏水性：C8、空载菌、重组菌对二甲苯的表面疏水性分别为10.12%、8.84%、13.88%，重组菌显著高于C8和空载菌；C8+空载为10.06%，C8+重组显著升至29.08%。3.7.9 共培养体系毒性实验：各菌及共培养组合对Caco-2细胞毒性作用较小，细胞活力较高，生物相容性良好。3.7.10 共培养体系黏附特性：C8、空载菌、重组菌黏附率分别为18.69 ± 0.34%、16.05 ± 0.02%、19.79 ± 0.62%，重组菌显著优于C8和空载菌；C8+空载为18.35 ± 0.29%，C8+重组为23.4 ± 0.81%；荧光图像显示C8+重组绿色荧光最强，表明共培养下黏附性能最佳。3.8 共培养体系生物被膜变化：CLSM显示C8生物被膜密度高、绿色荧光强、厚度3.78 μm；空载菌较不致密、厚度3.00 μm；重组菌较空载菌更致密、厚度3.26 μm；C8+空载密度增加、荧光增强、厚度3.38 μm；C8+重组生物被膜最致密、绿色荧光最强、厚度4.24 μm。

讨论部分总结：组氨酸激酶位于L. plantarum细胞膜上，是QS过程的重要组分，主要检测外部信号分子变化；信号肽位于蛋白N端，作为信号分子参与QS并影响生理功能和菌群间通讯；LPxTG结构蛋白是黏附相关表面蛋白，受QS调控并影响定植能力和生理功能。研究基于全基因组和蛋白质组数据鉴定WP_003643155.1、WP_015380110.1和WP_015640913.1，分子对接和分子动力学结果显示所选信号肽与预测组氨酸激酶在模拟条件下可稳定互作，支持信号肽-组氨酸激酶相互作用参与QS相关调控。研究人员构建的LPxTG结构蛋白与信号肽重组过表达菌株中靶基因表达显著上调；共培养增强QS效应、提高组氨酸激酶表达并激活下游响应调控转录因子，进而影响生长状态、产酸能力和AI-2荧光强度；胃肠耐受、自聚集、表面疏水性、Caco-2黏附及CLSM生物被膜结果均显示C8+重组共培养组优于其他组。研究结论翻译：总之，本研究以L. plantarum C8中含LPxTG结构域的表面蛋白和QS信号肽为靶点，在L. plantarum C8中构建了过表达系统，评估了靶基因表达水平以及重组菌株的生长和功能特性。结果表明，重组菌株中靶基因表达水平达到5.81，显示显著上调。此外，胃肠耐受试验、黏附试验和生物膜分析表明，重组菌株能够与L. plantarum进行QS，从而增强其肠道存活和黏附能力。CLSM显示L. plantarum C8与重组菌共培养形成的生物膜结构致密、荧光信号最强、厚度为4.24 μm。这些结果提示，重组菌株可能具有改善宿主肠道存活和定植的潜力。然而，这些结论仅限于所测体外指标，尚需体内宿主模型验证，以提供持久性、黏附和定植的直接证据。