基于免疫信息学与反向疫苗学的马尔堡病毒自扩增RNA多表位疫苗设计及其结构动力学与免疫模拟分析

《PLOS One》：Immunoinformatics and reverse vaccinology design of self-amplifying RNA vaccine against marburg virus with structural dynamics and immune simulation analysis

　　

马尔堡病毒病（MVD）是一种致命的人兽共患病，由马尔堡病毒（MARV）引起；MARV是一种单链RNA病毒，属于丝状病毒科（Filoviridae）正马尔堡病毒属（Orthomarburgvirus）。尽管该病毒具有高发病率和病死率，尤其在非洲，目前尚无获批的MARV疫苗或高效抗病毒治疗。鉴于其流行潜力及被列入世界卫生组织（WHO）蓝图优先病原体清单，研究人员采用免疫信息学方法，通过CD8⁺、CD4⁺和B细胞表位，设计靶向病毒糖蛋白（GP）、核蛋白（NP）、病毒蛋白40（VP40）和病毒蛋白35（VP35）的新型多表位自扩增RNA（saRNA）候选疫苗（MB-saVaxI和MB-saVaxII）。这些表位来自靶蛋白序列，并在验证抗原性、非致敏性、非毒性和保守性后被纳入MB-saVaxI和MB-saVaxII。此外，所选表位经多种连接肽与合适佐剂偶联，从而能够设计潜在稳定的疫苗。此外，所设计的MB-saVaxI和MB-saVaxII被整合到标准saRNA模型中，其中开放阅读框2（ORF-2）编码目标疫苗肽。生物物理分析显示，所开发疫苗为碱性（pI<7）、可溶性（GRAVY<0）且稳定（脂肪族指数<80）。随后，MB-saVaxI与Toll样受体2（TLR2）（?938.3）和TLR4（?902.4）对接，MB-saVaxII与TLR3（?1485.4）和TLR7（?1543.6）对接，显示显著亲和力；详细氢键相互作用经分子力学-广义玻恩表面积（MM-GBSA）和分子动力学模拟验证。此外，MB-saVaxI和MB-saVaxII在计算机中被有效克隆至大肠杆菌（Escherichia coli），免疫模拟表明疫苗可触发强固有免疫和适应性免疫，并具有持续记忆应答和辅助性T（TH）细胞活化，表现为干扰素γ（IFN-γ）和白细胞介素2（IL-2）产生。此外，MB-saVaxI和MB-saVaxII的mRNA结构在宿主表达通路中保持稳定。然而，仍需广泛的体外和体内研究以最终确定该候选疫苗的安全性和有效性。

马尔堡病毒病（Marburg virus disease，MVD）由高致病性马尔堡病毒（Marburg virus，MARV）引起，病死率可达24%—88%，WHO于2018年将其列为优先病原体。自1967年以来该病多次暴发，2025年坦桑尼亚报告10例病例和10例死亡；目前尚无FDA批准疫苗或特异性抗病毒治疗，且MARV研究受生物安全四级（BSL-4）实验室条件限制。现有实验性疫苗中，cAd3-MARV在首次人体1期试验（NCT03475056）中显示95%受试者产生GP特异性抗体，但作为复制缺陷型病毒载体，预存抗载体免疫可能降低重复给药效果，临床效力尚未证实；rVSV?G-MARV-GP候选疫苗（PHV01，NCT06265012；IAVI的rVSV?G-MARV-GP，NCT07425821）已进入1期，但作为复制 competent 活病毒疫苗可能存在反应原性和病毒血症，并需严格冷链，保护相关物尚未明确。传统疫苗研发耗时，而反向疫苗学（reverse vaccinology，RV）和自扩增RNA（self-amplifying RNA，saRNA）疫苗可在低剂量下产生较高抗原表达并诱导体液免疫；此前虽有多表位MARV疫苗的计算设计，但尚未专门组装saRNA疫苗。因此，研究人员采用免疫信息学方法设计靶向GP、NP、VP40和VP35的MB-saVaxI和MB-saVaxII，并得出其具有较高保守性、全球人群覆盖、TLR高亲和力及潜在持久免疫应答的结论；其意义在于为MVD提供候选saRNA疫苗设计框架，但需体外、体内和临床研究验证安全性与有效性。

关键技术方法：无临床样本队列，GP、NP、VP40和VP35序列来自NCBI（登录号YP_001531156.2、YP_001531153.1、YP_001531155.1、YP_001531154.1）。以IEDB预测CD8⁺、CD4⁺和线性B细胞表位，VaxiJen、AllerTop、ToxinPred筛选，分析保守性与人群覆盖；构建含VEEV亚基因组启动子、nsP1-nsP4、bL12佐剂、连接肽、MITD及UTR/poly(A)的saRNA骨架；用Expasy、SCRATCH、Protein-Sol评估生物物理，GOR4、SOPMA、PSIPRED、I-TASSER、二硫键工程、GalaxyWEB、ProSA、ERRAT、RamPlot分析结构质量；Ellipro预测构象B表位；ClusPro、HDOCK、MM-GBSA及200 ns分子动力学模拟；JCat、SnapGene计算克隆；C-IMMSIM免疫模拟；RNAfold分析mRNA结构。

结果如下。3.1 获取蛋白序列：通过NCBI蛋白数据库获得GP、NP、VP40和VP35的氨基酸序列（FASTA格式），用于后续表位预测。3.2 CD8⁺和CD4⁺表位鉴定：通过IEDB MHC I/II数据库预测9-mer CD8⁺和15-mer CD4⁺表位，MB-saVaxI选择6个CD8⁺和6个CD4⁺表位，MB-saVaxII选择8个CD8⁺和8个CD4⁺表位；经VaxiJen、AllerTop和ToxinPred筛选后选用最具抗原性、非致敏和非毒性表位，但MB-saVaxII的CD4⁺表位GLYPQLSAI虽具抗原性却被预测为致敏。3.3 线性B细胞表位鉴定：通过IEDB鉴定并选择6个线性B细胞表位，预测其具抗原性、非毒性和非致敏性；但MB-saVaxII的VGEQYQQL和LRAVPPNPTID被预测为致敏。3.4 表位保守性分析：通过IEDB Epitope Conservancy Analysis Tool分析，所选表位高度保守；MB-saVaxI中GP为21.05%—94.74%、NP为50%—100%、VP40为88.89%—94.44%、VP35为87.50%—100%；MB-saVaxII中GP为21.05%—94.74%、NP为42.31%—100%、VP40为94.44%—100%、VP35为91.67%—100%。3.5 人群覆盖分析：通过IEDB population coverage tool评估，MB-saVaxI和MB-saVaxII合并CD8⁺与CD4⁺表位的全球人群覆盖率分别为98.98%和96.21%；MB-saVaxI以中美洲最高（99.75%），西非和北美为99.5%；MB-saVaxII以东非最高（99.06%）；最低分别为南非64.63%和中美洲55.01%。3.6 疫苗骨架制备：将筛选表位与EAAAK、AAY、GPGPG和KK连接肽及bL12佐剂组装为多表位抗原序列（ORF2），并构建由5′帽（m⁷G）、5′UTR、ORF1（nsP1-nsP4复制酶复合体）、亚基因组启动子、Kozak序列、tPA信号肽、ORF2、MITD转运信号、3′UTR和poly(A)尾组成的saRNA架构。3.7 合成后蛋白修饰分析：NetNGlyc、NetPhos和NetAct预测显示，MB-saVaxI在269 NLSG有N-糖基化位点，MB-saVaxII在211 NPTL、257 NISV、303 NLSG和453 NPTI有N-糖基化位点；MB-saVaxI和MB-saVaxII分别有22和18个磷酸化位点，均无乙酰化位点。3.8 生物物理特征评估：Expasy ProtParam、SCRATCH和Protein-Sol分析显示，MB-saVaxI和MB-saVaxII分别含6449和6837个原子、438和472个氨基酸，分子量为45928.45和48669.81 Da，pI为5.00和6.65，GRAVY为?0.282和?0.298；不稳定性指数为32.01和24.15，脂肪族指数为82.40和74.22；SOLpro溶解性概率为0.946257和0.944209，Protein-Sol为0.713和0.420；二者具抗原性（0.6051和0.5811）且非致敏。3.9 二级结构测定：GOR4预测MB-saVaxI无规卷曲、延伸链和α螺旋分别为42.01%、5.02%和52.97%，MB-saVaxII为44.07%、13.14%和42.80%；SOPMA预测MB-saVaxI为40.64%、9.13%和46.12%，MB-saVaxII为46.40%、14.62%和35.38%；PSIPRED进一步给出螺旋、链和卷曲分布。3.10 三级结构测定、稳定化、精修和质量评价：通过I-TASSER建模并按C-score、TM-score和RMSD选择模型；Disulfide by Design预测MB-saVaxI 34对、MB-saVaxII 44对潜在二硫键候选，各选4对引入；GalaxyWEB精修后MB-saVaxI和MB-saVaxII的RMSD为0.328和0.277、MolProbity为2.087和1.918；ERRAT质量因子为86.5707和77.686，ProSA Z-score为?7.75和?5.82；Ramachandran图显示MB-saVaxI最 favored 区和允许区分别为93.35%和4.82%，MB-saVaxII为91.70%和7.02%。3.11 构象B细胞表位测定：Ellipro在MB-saVaxI的438个残基中识别9个构象B细胞表位，突出指数（PI）为0.535—0.887；MB-saVaxII的PI为0.548—0.839。3.12 疫苗与TLR分子对接：ClusPro 2.0显示MB-saVaxI-TLR2最低能量为?938.3、MB-saVaxI-TLR4为?902.4，MB-saVaxII-TLR3为?1485.4、MB-saVaxII-TLR7为?1543.6；PDBsum显示各复合体形成盐桥、氢键和非键相互作用，表明显著亲和力。3.13 T细胞表位与HLA分子对接：HDOCK评估CD8⁺和CD4⁺表位与人白细胞抗原（HLA）I/II类分子的对接，所选表位均获得负对接分数，提示其与HLA分子具有结合潜力。3.14 MM-GBSA负自由能计算：HawkDock显示MB-saVaxI-TLR2和MB-saVaxI-TLR4结合自由能为?65.44和?101.69 kcal/mol，MB-saVaxII-TLR3和MB-saVaxII-TLR7为?142.71和?184.35 kcal/mol，支持复合物结合稳定性。3.15 分子动力学模拟：200 ns模拟以RMSD、RMSF、rGyr和氢键分析评估MB-saVaxI-TLR复合物。3.15.1 RMSD分析：MB-saVaxI-TLR2和MB-saVaxI-TLR4平均RMSD为9.107和5.284 ?，TLR4复合物结构稳定性更高。3.15.2 RMSF分析：二者平均RMSF为2.664和1.966 ?，均低于10 ?，提示整体结构稳定。3.15.3 rGyr分析：平均rGyr为30.401和34.526 ?，TLR2复合物构象稳定，TLR4复合物存在波动但提示构象柔性。3.15.4 氢键分析：平均氢键数为469.549和484.056，二者氢键稳定性相当。3.16 密码子优化和计算克隆：JCat在大肠杆菌K12中优化后获得1314 nt MB-saVaxI和1416 nt MB-saVaxII，GC含量为51.44%和52.82%，CAI为0.98和0.99；优化序列经SnapGene插入pcDNA3.1(+)载体。3.17 免疫应答模拟：C-IMMSIM以28天间隔模拟三剂接种，显示TC细胞、TH细胞和TR细胞升高，第70天活性及记忆TH细胞增加，一年后活性TR和TC仍高；记忆B细胞升高，总B细胞持续活性；IgM⁺/IgG滴度第60天最高、第100天后下降并在1年内维持；抗原浓度在第1、25、50天出现峰值；细胞因子应答持续1年，自然杀伤（NK）细胞和树突状细胞（DC）高水平持续，提示持久免疫。3.18 mRNA疫苗二级结构建模：RNAfold显示MB-saVaxI mRNA最优和质心结构MFE为?407.40和?330.90 kcal/mol，热力学集合自由能为?429.41 kcal/mol；MB-saVaxII最优和质心结构MFE为?461.50和?276.80 kcal/mol，集合自由能为?485.64 kcal/mol，提示mRNA结构稳定。

讨论部分将本研究与Mohamed et al. (2022)、Bishal et al. (2023)、Saad et al. (2021)和Fouad et al. (2024)等比较：本研究的全球人群覆盖率、不稳定性指数、脂肪族指数、结构质量、TLR对接能量及200 ns分子动力学时间尺度等方面显示出较全面的计算评估；同时指出saRNA疫苗可在细胞内复制并较长时期产生抗原，低剂量即可诱导持久保护。局限包括仅基于免疫信息学预测、无实验验证、结构预测可能不准确、缺乏慢性免疫预测、表位预测受算法和数据库及HLA覆盖偏倚影响、分子动力学时间尺度有限，故需体外、动物及临床研究验证免疫原性、有效性和安全性。研究结论翻译：下一代免疫信息学技术通过计算工具设计针对高致病、危及生命疾病的疫苗，已使这类疾病的预防和控制成为可能。本研究旨在靶向参与致病过程的蛋白，构建针对MVD的saRNA候选疫苗。研究结果表明，利用抗原性表位设计的疫苗有潜力诱导强免疫应答而不引起过敏反应或毒性。所选表位显示高度保守性，并在全球不同地区具有较高人群覆盖。分子对接分数表明其与TLR2、TLR3、TLR4和TLR7受体具有高亲和力相互作用，并进一步经MM-GBSA分析验证。该疫苗在细菌载体中表达时显示较强克隆潜力，免疫应答模拟提示其可有效刺激细胞介导和抗体介导的免疫应答。此外，mRNA稳定性通过热力学自由能和MFE值评估。总体而言，这些发现表明该生物信息学设计的疫苗是应对MVD的强有力且可行候选。然而，这些发现必须通过实验室和动物试验验证疫苗效力和安全性。