《Environment International》：Equivalence testing in pesticide risk assessment: evaluation and practical guidance for design, analysis and interpretation
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欧洲食品安全局（EFSA）的等效检验与监管目标一致且实施可行。通过反聚类随机化实现均衡的蜂群分配可提高统计功效。调整初始蜂群规模可在0–5%效应量下将所需试验点数量减少2–10个。提供R语言指南以实现反聚类随机化及等效检验。提供等效检验及补充检验在风险分类中的
欧洲食品安全局（EFSA）的等效检验与监管目标一致且实施可行。通过反聚类随机化实现均衡的蜂群分配可提高统计功效。调整初始蜂群规模可在0–5%效应量下将所需试验点数量减少2–10个。提供R语言指南以实现反聚类随机化及等效检验。提供等效检验及补充检验在风险分类中的解读指南。
**论文解读：农药风险评估中等效检验的统计特性、样本量优化与实践建议**
**1. 研究背景与问题**
农药对非靶标生物的负面影响在全球范围内受到广泛关注，而农药上市前必须通过生态风险评估。传统的风险评估采用分层（tiered）体系：低层级的室内试验若提示潜在风险，则需在更高层级（如半田间和田间试验）进行更接近现实暴露条件的验证。传统的高层级研究通常采用显著性检验（即差异检验，difference testing），将“未检测到显著负面影响”视为安全的证据。然而，这种范式存在根本性缺陷：低统计功效的研究可能因高变异或低重复而无法检出不显著的负面效应，导致有害农药通过审批。例如，欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）在2013年的蜜蜂风险评估指南中要求研究具备80%的功效以检测7%的蜂群规模下降，但在对新烟碱类杀虫剂的63项半田间和田间试验评估中，没有一项达到这一功效要求，且仅有不到27%的研究能够检测出超过35%的大幅工蜂减少。这一统计功效不足的问题被认为是多种对传粉者有害的农药通过欧盟审批、事后被禁用的重要原因之一。
为应对上述问题，EFSA于2023年发布了修订版蜜蜂风险评估指南，实现了从差异检验到等效检验（equivalence testing）的概念转变。在该新范式下，农药申请者必须提供证据表明负面影响小于既定阈值——即特定保护目标（Specific Protection Goal, SPG），具体而言，单向等效检验（α=0.2）需证明农药组相比对照组蜂群规模的减少显著小于10%，方可得出“低风险”结论。
然而，Hotopp等人（2024）通过模拟研究发现，依据EFSA新指南，多数情况下等效检验结果不显著，被解读为虚假的“高风险”结论，因此认为满足监管批准标准过于困难。他们提出了一种修改后的等效检验（以下简称“Hotopp检验”），将效应量计算的基线从对照组均值移至对照组均值90%置信区间的下限，并认为这能反映蜜蜂群落的自然变异性。但本文研究人员对此持保留态度，认为Hotopp检验可能仅是降低了检验的严格程度，而非本质上更优，且可能以增加“虚假信任”（即将高风险农药误判为低风险）为代价。基于此，本研究旨在系统性比较EFSA等效检验与Hotopp检验在区分高风险和低风险农药方面的能力，量化EFSA指南下的样本量需求，并评估通过协变量调整（包括统计调整和设计优化）提升统计功效的可行性，最终为实际风险评估提供操作性指导。
**2. 研究开展的工作与结论**
研究人员基于Rolke等人（2016）提交给监管机构用于新烟碱类杀虫剂再授权的田间试验中的对照组数据，采用参数自助法（parametric bootstrap）模拟了不同样本量、不同真实效应量和不同协变量调整策略下的风险评估过程。主要结论包括：其一，EFSA等效检验在控制虚假信任率方面显著优于Hotopp检验，后者在名义α=0.2时实际等效α水平远高于名义值，导致对超过SPG阈值（如?12%至?15%）的农药高比例误判为低风险；其二，在EFSA等效检验框架下，对于真实效应量为0%的农药，调整初始蜂群规模后仅需6–7个试验点/处理即可达到80%功效，而不调整时需9个，对于效应量为?5%的农药，调整可使所需试验点从约34个降至24–25个；其三，与2013年EFSA旧指南（采用差异检验）相比，新指南即使对中等效应量（?5%）的农药也降低了样本量需求（旧指南需29–41个试验点）。研究还提供了实现反聚类随机化和等效检验的R函数及实践指南。
**3. 主要关键技术方法**
本研究采用以下关键技术方法：（1）参数自助法（parametric bootstrap），从Rolke等人（2016）的对照组数据中提取分布参数，生成具有相似统计特征的模拟数据集；（2）广义线性混合效应模型（Generalised Linear Mixed-effects Model, GLMM），使用负二项误差分布拟合模拟数据，并估计处理效应；（3）四种协变量调整策略——不调整、设计调整（通过新开发的R函数experimental_allocation()采用反聚类随机化实现初始蜂群数量在试验点和处理间的平衡）、统计调整（将初始蜂群数量作为固定效应协变量纳入模型）、联合调整（设计与统计调整结合）；（4）三种风险分类检验——EFSA等效检验、Hotopp等效检验和差异检验。所有模拟重复5000次，以估计农药被分类为“低风险”的概率。模拟研究以Rolke等（2016）的田间试验为数据基础，该试验包含12个试验点（6个处理、6个对照），每个处理组6个蜂群，符合典型监管田间研究的规模。
**4. 研究结果**
**4.1 EFSA与Hotopp等效检验的比较**
模拟结果显示，两种检验在“虚假信任”和“虚假不信任”（即将低风险农药误判为高风险）之间的权衡关系完全相同，即二者在区分高风险与低风险农药的内在能力上没有差异。然而，二者的校准存在巨大差异：要达到与EFSA等效检验在α=20%时相同的保护水平，Hotopp检验需要将α设定为约2%。这意味着，Hotopp检验在名义α=0.2下实际产生的虚假信任率远高于名义水平。例如，在每处理6个试验点的典型研究中，Hotopp检验将真实效应量为?12%的农药在50%的情况下误判为“低风险”，而EFSA检验在所有测试效应量下均将虚假信任率控制在20%以下。即使在EFSA推荐的10个试验点/处理（每点6个蜂群）样本量下，Hotopp检验对?12%和?15%效应量农药的误判率仍高达48%和26%。
**4.2 不同调整策略下的样本量需求**
使用EFSA等效检验，对于效应量为0%的农药，调整初始蜂群规模后仅需6–7个试验点/处理即可达到80%功效，而不调整时需9个；对于效应量为?5%的农药，调整可将所需试验点从约34个显著减少至24–25个，减少近10个试验点。值得注意的是，若采用2013年EFSA指南的差异检验框架，即使调整协变量，检测?7%效应量仍需29个试验点，不调整时则需41个。这表明新等效检验框架不仅保护水平更高，对于低至中等风险农药的验证可行性也优于旧指南。
**5. 讨论与结论**
讨论部分强调，EFSA等效检验将效应量与SPG直接比较，使统计检验与监管决策目标明确对齐，避免了差异检验中“不显著即安全”的逻辑谬误。Hotopp检验虽名义上考虑了对照组的自然变异性，但实质上仅是改变了校准基线，导致α水平含义失真，且可能鼓励通过增大背景变异来降低等效检验难度，这在监管伦理上显然不可取。研究还指出，统计调整和设计调整（反聚类随机化）在提高功效方面同样有效，但设计调整不消耗自由度且不易受分析阶段的选择性操作影响，因而更值得推荐。
结论部分指出，EFSA的等效检验在统计上稳健且在实际中可行，尤其对于真实效应量较小的农药，采用合理样本量和协变量调整即可达到监管要求。该检验通过严格控制虚假信任率，确保决策透明且可解释，并激励申请者开展充分重复的研究。这些原则可推广至所有层级生态毒性试验：设定明确的效应阈值保护目标、针对阈值进行非劣效检验、必要时从相反方向检验以证明高风险、并优先采用预先指定的方差削减策略（如反聚类随机化平衡分配或协变量纳入），以降低有害农药获批概率，实现监管结果与环境目标的统一。
