《Environmental Challenges》：Evaluating Whole-Transcriptome Responses of Stream Organisms to WWTP Improvements and Environmental Stressors
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污水处理厂是地表水中微污染物的重要来源，许多国家正在采用先进技术升级处理设施以减少微污染物排放。然而，仅靠化学监测难以提供关于这些措施对水生生物生物学响应的充分信息。本研究应用全转录组测序技术，调查了在瑞士两座污水处理厂上下游原位暴露的淡水钩虾在微污染物去除阶
污水处理厂是地表水中微污染物的重要来源，许多国家正在采用先进技术升级处理设施以减少微污染物排放。然而，仅靠化学监测难以提供关于这些措施对水生生物生物学响应的充分信息。本研究应用全转录组测序技术，调查了在瑞士两座污水处理厂上下游原位暴露的淡水钩虾在微污染物去除阶段实施前后的生物学响应。钩虾被放置在笼中暴露四周，随后通过下一代测序评估基因表达模式。EcoImpact II项目中的化学监测显示，处理升级后污水处理厂出水中54种监测微污染物的总和浓度有所下降。在Muri污水处理厂，颗粒活性炭过滤实施后，2021年至2025年间平均出水浓度下降了约98%。在Oberglatt污水处理厂，粉末活性炭处理安装后，2020年至2022年间观测到约43%的较为温和的下降。这些百分比代表测量到的出水浓度的时间变化，而非直接确定的处理去除效率。转录组响应在不同地点间差异显著。在Oberglatt，升级前后上游与下游生物之间的基因表达差异较小，表明暴露位点间的转录组响应差异有限。相比之下，Muri污水处理厂下游的钩虾在升级前表现出显著的转录组响应，涉及数千个差异表达转录本。尽管中间年份检测到的差异表达转录本较少，但在2025年，尽管污水处理厂出水中微污染物浓度大幅降低，仍观测到显著的转录组信号。水文数据显示，这恰逢强降水期间溢流事件释放未经处理的废水。这些发现表明，转录组学方法能够揭示对环境复杂条件的分子响应，同时也凸显了在多变环境条件下解释野外组学数据的挑战。此类转录组响应指示分子扰动，但不能单独归因于特定胁迫因子，也不能解释为生理损伤或不利生态效应的证据。
研究背景与科学问题
污水处理厂是地表水环境中微污染物的重要点源。尽管三级处理工艺可有效去除常规污染物，但对药品、农药、内分泌干扰物等微污染物去除效率有限。已有研究表明，即便在环境相关浓度下，长期暴露于微污染物也可能对水生生物产生亚致死慢性效应，如摄食行为改变、呼吸代谢紊乱及种群敏感性增加。然而，传统化学监测仅能反映单一化合物的浓度变化，无法全面表征复杂混合污染物对生物体的综合效应。同时，现有实验室毒性试验多聚焦于单化合物或简单混合物，难以模拟真实环境中多达数百种共存化学品的情景。因此，亟需发展能够整合复杂环境暴露信息的生物学评估手段，以判断污水处理厂升级改造是否真正带来可测量的生态改善。
基于上述问题，研究人员开展了此项研究，旨在利用全转录组测序技术评估瑞士两座污水处理厂升级前后，原位暴露钩虾的基因表达变化，从而探究：（1）下一代测序技术是否适用于野外效应评估；（2）转录组响应能否检测到与水质改善相关的生物学变化；（3）该技术能否为先进处理工艺的环境风险管理提供依据。
关键技术方法
研究人员在两座瑞士污水处理厂开展野外实验。Oberglatt厂采用粉末活性炭处理，Muri厂采用颗粒活性炭过滤。研究人员从当地采集雄性钩虾个体，分别放置于各厂上游和下游的笼中，进行为期约四周的原位暴露。暴露结束后提取单个钩虾总RNA，构建mRNA文库，利用Illumina NextSeq 550平台进行全转录组测序。数据经Trinity组装、Salmon定量、DESeq2差异表达分析和GSEA功能富集分析。化学监测由Eawag主导的EcoImpact II项目同步开展，采用被动采样器和LC-MS/MS测定54种微污染物浓度。
研究结果
3.1 Oberglatt
在Oberglatt厂，化学监测显示2020至2022年间出水中54种微污染物总和浓度从39.98 μg/L降至22.66 μg/L，降幅约43.3%。重金属方面，锰、铁、铜、钴浓度显著下降，而镍和锌浓度有所上升。营养盐指标如磷、铵态氮等也明显改善。转录组分析显示，2021年升级前仅有46个转录本在下游与上游间差异表达，其中39个上调、7个下调；2022年升级后检出33个差异表达转录本，其中26个上调、7个下调。两年间差异表达转录本重叠度极低。主成分分析显示两年样品均未形成清晰的上游-下游分离簇。基因集富集分析表明，2021年下游钩虾呈现生物合成和能量代谢过程下调、肌肉发育和离子转运相关基因上调的趋势，但2022年未能识别出明确的生物学通路变化。
3.2 Muri
在Muri厂，化学监测显示2021至2025年间出水中微污染物总和浓度从32.97 μg/L降至0.68 μg/L，降幅约97.9%。重金属方面，锌和钴的上下游差异消失，铝、铁、锰、铜、铬浓度也显著下降。然而营养盐负荷在升级后仍维持较高水平。转录组分析显示，2021年升级前检出6048个差异表达转录本，2022年为5880个；2023和2024年过渡期数量减少；而2025年完全升级后竟高达15701个，为所有年份最高。主成分分析显示2025年首次出现清晰的上游-下游样品分离。水文记录表明，2025年暴露末期恰逢强降雨引发溢流池启动，未经处理的废水短时排入河流。基因集富集分析在2025年末能识别出一致的生物学通路模式，但2024年观察到DNA修复和细胞周期进程的上调。
讨论与结论
讨论部分指出，化学监测证实了两座厂的升级确实降低了微污染物浓度，但转录组响应反映了多种环境胁迫因子的综合效应。Oberglatt厂生物学变化有限的原因可能包括上游背景污染严重，以及上游站点本身并非无污染的对照位点。Muri厂2025年的强烈转录组信号最合理的解释是溢流事件导致未经处理废水短时排入，叠加高流速和高浊度的物理胁迫。研究人员强调，差异基因表达是分子扰动的敏感指标，但不能直接等同于生理损伤或生态危害。研究还指出了多项局限性：化学监测与生物学暴露未完全同步、不同年份的测序质量和批次效应、野生个体固有的物种组成和生理状态变异、以及非模式生物基因组注释不完善等问题。最终结论认为，转录组学可作为补充化学监测和生态评估的探索性工具，但目前尚不足以作为独立的监管评价手段。
