《Current Research in Food Science》：Mechanochemical unfolding facilitates protein-glutaminase deamidation and charge remodeling of myofibrillar protein to reduce low-salt-induced aggregation tendency
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低盐诱导的肌原纤维蛋白（MP）聚集倾向会降低其在低离子强度条件下的溶解性和功能性能。本研究探讨高压微流化（HPM）诱导的机械化学去折叠是否能促进蛋白谷氨酰胺酶（PG）对MP的脱酰胺和电荷重塑，以降低低盐诱导的聚集倾向。将低盐条件（0.1 mol/L NaCl）
低盐诱导的肌原纤维蛋白（MP）聚集倾向会降低其在低离子强度条件下的溶解性和功能性能。本研究探讨高压微流化（HPM）诱导的机械化学去折叠是否能促进蛋白谷氨酰胺酶（PG）对MP的脱酰胺和电荷重塑，以降低低盐诱导的聚集倾向。将低盐条件（0.1 mol/L NaCl）下分散的MP分别经52、69、86和103 MPa的HPM处理，随后进行PG脱酰胺，并分析其脱酰胺度（DD）、溶解度、颗粒特性、表面电荷、构象变化、分子相互作用及组装形态。HPM破坏高度交联的MP结构并促进构象去折叠，从而提高PG介导脱酰胺的底物可及性。顺序HPM-PG处理显著改善低盐MP分散，HPM预处理后DD由5.94%提高至11.45%，溶解度由未处理MP的34.5%提高至MP-15000H-PG的71.2–71.94%。该改善与粒径降低相关，MP-10000H-PG和MP-15000H-PG分别降至1408.67和1254.67 nm。此外，ζ电位（ζ-potential）由?11.63 mV变为?25.96 mV，表明PG介导的谷氨酰胺（Gln）残基向谷氨酸（Glu）残基转化可能重塑了MP电荷。二级结构、荧光、巯基、透射电子显微镜（TEM）和不对称流场-流分离（AF4）分析进一步表明，顺序处理破坏丝状聚集体、暴露反应性基团，并阻止其聚集为粗大肌原纤维结构。这些发现阐明，机械化学去折叠辅助PG脱酰胺可将低盐重组MP转化为电荷稳定的分散状态，为开发用于减盐食品体系的高溶解性肉蛋白配料提供了分子策略。
研究背景：肌原纤维蛋白（myofibrillar protein, MP）是肉体系关键功能蛋白，但低盐诱导的MP聚集严重限制其在减盐食品中的分散和利用。常规肉制品通常添加2–3% NaCl以提高离子强度，促进MP溶解和水合，并赋予凝胶、乳化和保水等功能；然而长期高钠摄入与高血压及心血管疾病风险相关，肉制品贡献近五分之一的日均钠摄入，减盐加工需求迫切。降低NaCl浓度会降低体系离子强度，使MP溶解度骤降并易聚集，难以稳定分散和发挥功能。已有物理、化学、生物改性及超声辅助酶解、高压均质辅助酶解、糖基化辅助脱酰胺等策略，但低盐下MP稳定分散仍未根本解决：低盐环境中MP分子间静电斥力不足，疏水作用主导形成不溶性聚集体；现有改性多仅作用于蛋白表面或仅部分去折叠，未能同时重建分子间静电斥力。高压微流化（high-pressure microfluidization, HPM）可产生强剪切、空化和瞬态压降，破坏MP聚集体、诱导结构松散并暴露埋藏基团，但不能改变蛋白内在电荷，低盐下去折叠暴露的疏水区易再聚集，过度处理可致过变性；蛋白谷氨酰胺酶（protein-glutaminase, PG）可催化Gln侧链脱酰胺为Glu，引入负电荷、提高ζ电位绝对值和静电斥力，但催化效率依赖底物可及性，天然紧密折叠限制Gln接触，单独使用常需高酶量或长孵育。HPM与PG序贯用于控制低盐MP聚集尚不清楚，因此研究人员提出HPM破坏有序MP丝结构并形成部分去折叠态，随后PG将Gln转为Glu、增加静电斥力并维持MP片段电荷稳定分散的假设并开展研究。
研究开展与总体结论意义：研究人员将低盐（0.1 mol/L NaCl）分散的MP经52、69、86、103 MPa HPM处理，再进行PG脱酰胺，分析DD、溶解度、颗粒特性、表面电荷、构象、分子相互作用、组装形态、流动性和分散稳定性。结果表明顺序HPM-PG显著提高DD和低盐溶解度，降低粒径并增强负ζ电位，破坏丝状聚集体，使MP由低盐再组装聚集态转为电荷稳定分散态；这为减盐食品体系高溶解肉蛋白配料提供了分子策略。
关键技术方法：以新鲜鸡胸肉为原料（样本购自Freshippo, Alibaba Group，Nanjing, China），参照Liu等的方法提取MP；在0.1 mol/L NaCl低盐条件下进行52、69、86和103 MPa的HPM处理；随后以PG（16 U/g MP）在37 °C脱酰胺16 h。测定指标包括溶解度、DD、粒径与ζ电位、圆二色谱（circular dichroism, CD）、内源荧光、表面疏水性、反应性巯基（reactive sulfhydryl, R-SH）/总巯基（total sulfhydryl, T-SH）、TEM、AF4-UV-MALS、Turbiscan稳定性指数（Turbiscan stability index, TSI）及稳态剪切流变；以至少三个独立生物学批次进行ANOVA和LSD多重比较（P < 0.05）。
研究结果：3.1 HPM辅助PG脱酰胺提高低盐MP溶解度：溶解度测定显示未处理MP约34%，HPM-PG后显著提高至70%以上，MP-15000H-PG达71.94%，说明HPM预处理提高PG脱酰胺效率并增强低盐分散。3.2 机械化学去折叠促进构象重塑：3.2.1二级结构：CD显示HPM使α-螺旋由5.6%增至23.8%，HPM-PG进一步增至31.6%、β-折叠由29.6%降至16.8%，表明有序结构破坏和重排；3.2.2三级结构：内源荧光、表面疏水性和R-SH显示HPM及HPM-PG促使色氨酸（Trp）残基、疏水基团和反应性巯基暴露，T-SH无规律变化。3.3 电荷重塑稳定MP分散：3.3.1 DD：MP-PG为5.94%，MP-H-PG为7.98%–12.01%，说明HPM提高底物可及性；3.3.2粒径：HPM单独使粒径增大，HPM-PG显著降低，MP-10000H-PG和MP-15000H-PG分别降至1408.67和1254.67 nm；3.3.3 ζ电位：顺序处理使ζ电位由?11.63 mV变为?25.96 mV，增强静电排斥。3.4 形态与AF4证据用于抑制聚集：3.4.1形态变化：TEM显示未处理MP为完整纤维，HPM后纤维断裂，HPM-PG呈珠状或肌球蛋白样并降低聚集比例；3.4.2 AF4分析：AF4-UV-MALS显示HPM-PG提高<0.45 μm可过滤组分的分散性，回转半径（R
g）降低，MP-15000H-PG最低，说明抑制低盐聚集。3.5 流变行为与分散稳定性：3.5.1 TSI：TSI随时间下降，HPM-PG进一步降低，MP-15000H-PG最低，表明分散稳定性提高；3.5.2稳态剪切流变：未处理MP呈剪切变稀，HPM后黏度显著下降并在测试剪切范围内表现牛顿流体特征，HPM-PG进一步降低黏度，表明流动性能改善。3.6 整合机制：结果支持两阶段机制，HPM机械化学解聚和去折叠暴露Gln及带电基团，PG脱酰胺将Gln转为Glu、增加负电荷和静电斥力，抵消疏水吸引并锁定分散；适度机械去折叠与适度脱酰胺的协同窗口避免过度变性和再聚集。
讨论部分总结：原文将机制归纳为两阶段：HPM通过强剪切、空化和瞬态压降破坏低盐下由疏水作用主导的MP不溶性聚集体，诱导适度去折叠并暴露Gln和带电基团，增加酶可及性；随后PG在37 °C、16 h催化Gln侧链酰胺向羧基转化，提高表面负电性，以强分子间静电斥力抵消低离子强度下的疏水吸引，使去折叠肽链以单分子或小质量寡聚体稳定分散，并提高溶解度、分散稳定性并降低剪切黏度。研究指出，适度机械去折叠可保证底物可及性而不过度变性，适度脱酰胺提供足够静电斥力，二者在最佳协同窗口形成以静电斥力为主、构象适度伸展的高稳定低盐MP分散体系。研究结论翻译：顺序HPM和PG脱酰胺通过机械化学去折叠与酶电荷重塑有效降低低盐诱导的MP聚集倾向。但实验设计未包括完全孵育匹配的非PG对照，因此观察到的效应应解释为37 °C孵育条件下PG处理的综合影响，而非纯酶效应。在此限制下，结果表明HPM破坏有序肌原纤维结构并提高PG介导脱酰胺的底物可及性，PG诱导脱酰胺将中性Gln残基转化为带负电Glu残基，增强静电斥力并稳定MP片段分散状态。因此，MP-15000H-PG的低盐溶解度显著提高至71.94%，同时粒径降低、绝对ζ电位增加、α-螺旋含量增加、β-折叠含量降低，并暴露反应性巯基和疏水基团；TEM和AF4联合分析进一步证实大丝状聚集体被破坏及低盐条件下微粒受到抑制。这些发现揭示HPM辅助PG脱酰胺不仅是组合加工方法，而是用于减盐食品体系生产电荷稳定肉蛋白分散体的机械化学–酶策略。
