《Current Research in Food Science》：Phosphorylation of macadamia protein isolate: Unveiling the mechanism behind enhanced solubility and high internal phase emulsion stability
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研究人员采用三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate, STPP）和三偏磷酸钠（sodium trimetaphosphate, STMP）对澳洲坚果蛋白分离物（Macadamia protein isolate, MPI）进行磷酸化处理，并
研究人员采用三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate, STPP）和三偏磷酸钠（sodium trimetaphosphate, STMP）对澳洲坚果蛋白分离物（Macadamia protein isolate, MPI）进行磷酸化处理，并研究了磷酸化对其溶解性、结构及高内相乳液（high internal phase emulsion, HIPE）稳定性的影响。STPP和STMP均在添加量为5%时达到最高磷酸化程度，磷含量分别为3.95 ± 0.05和3.22 ± 0.02 mg/g。傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）和X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy, XPS）证实，磷酸基团通过形成含磷键成功引入MPI。磷酸化显著改变了MPI的聚集状态和分子构象。其中，STMP处理的MPI在添加量为4%时溶解度最高，而5% STPP处理的MPI综合性能最佳，粒径从197.9 ± 0.99 nm降至165.2 ± 0.57 nm，绝对zeta电位从25.77 ± 0.06 mV增至70.67 ± 0.41 mV，溶解度从14.01% ± 0.72%增至96.78% ± 0.24%。此外，磷酸化提高了表面疏水性和游离巯基含量，并促进了β-折叠和β-转角结构向α-螺旋和无规卷曲结构的转变，表明MPI发生了显著的构象重排。这些变化改善了MPI的水分散性和界面吸附行为。因此，5% STPP处理的MPI表现出优异的HIPE稳定能力，可形成更小的液滴尺寸和更均匀致密的微观结构，而天然MPI在80%内相分数下无法稳定HIPE。总体而言，磷酸化是改善MPI功能特性并拓展其在基于HIPE的食品体系中应用的有效策略。
随着坚果和油料加工副产物中植物蛋白的高值化利用越来越受到重视，以植物蛋白作为天然颗粒稳定剂构建乳液递送体系成为研究热点。高内相乳液（high internal phase emulsion, HIPE）通常指内相体积分数超过74%的乳液，其独特的高黏度、凝胶网络结构和储存稳定性使其在脂肪替代、生物活性物质包埋及功能食品开发中具有广阔前景。澳洲坚果加工副产物中提取的蛋白分离物（Macadamia protein isolate, MPI）具有优良的氨基酸组成，但其因结构致密、易聚集而表现出较差的水溶性和界面活性，难以有效稳定高内相乳液。化学修饰中，磷酸化可通过引入磷酸基团增加蛋白质表面负电荷、增强静电排斥，并诱导构象重排，从而改善蛋白质功能特性。常用磷酸化试剂三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate, STPP）和三偏磷酸钠（sodium trimetaphosphate, STMP）结构不同，可能产生差异化修饰效果。然而目前针对MPI的STPP/STMP磷酸化修饰及其对HIPE稳定性的影响仍缺乏系统报道。为此，研究人员以MPI为对象，系统比较STPP和STMP磷酸化对其结构、理化性质和HIPE稳定性的影响，并揭示相关机制。该研究为坚果蛋白副产物的深加工和植物蛋白基HIPE稳定剂的开发提供了理论依据。
研究人员以中国热带农业科学院南亚热带作物研究所提供的澳洲坚果压榨饼为原料，经碱提酸沉法制备MPI。随后分别采用不同添加量的STPP或STMP对MPI进行磷酸化处理，获得磷酸化MPI。测定方法包括：钼蓝法测定磷酸化程度；凯氏定氮法测定溶解度；动态光散射/电泳分析粒径与zeta电位；透射电镜观察形貌；内源荧光光谱、表面疏水性、巯基/二硫键测定评价分子构象；圆二色谱分析二级结构；傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）和X射线衍射（XRD）验证磷酸基团引入及结构变化。随后以筛选出的最优磷酸化MPI（5% STPP处理，记为LMPI）与天然MPI为稳定剂，制备内相分数为75%和80%的HIPE，并采用激光粒度仪、zeta电位仪、激光共聚焦显微镜、界面吸附测定及流变仪对其性能进行表征。
3.1 磷酸化程度：磷含量测定显示，MPI天然磷含量为0.27 mg/g；随试剂添加量增加，STPP和STMP组的结合磷含量先升后降，均在5%添加量时达最大值（分别为3.95和3.22 mg/g），且STPP的磷酸化效率高于STMP。
3.2 溶解度：溶解度测试表明，天然MPI溶解度仅14.01%；磷酸化后显著提高，5% STPP处理达96.78%，4% STMP处理达84.57%，表明磷酸化增强了蛋白水化与分散性。
3.3 粒径与zeta电位：动态光散射和电泳结果显示，磷酸化使蛋白上清液粒径从197.9 nm降至165.2 nm（5% STPP），绝对zeta电位从25.77 mV增至70.67 mV，说明磷酸基团引入提高了表面负电荷，抑制聚集。
3.4 形貌分析：透射电镜观察发现，天然MPI呈不规则球形且存在严重聚集；2%–5%磷酸化处理后颗粒变小、更均匀；6%添加量时出现再聚集，与粒径和电位结果一致。
3.5 分子特性分析：内源荧光显示最大发射波长由347 nm红移至约351 nm，表明色氨酸残基暴露于极性环境；表面疏水性在5%添加量时达最大值（STPP组18599，STMP组19772）；游离巯基含量增加而二硫键减少；圆二色谱显示α-螺旋和无规卷曲比例增加，β-折叠和β-转角减少；FTIR和XPS证实样品中出现P-O、P=O及C-O-P键，表明磷酸基团成功引入；XRD显示中等磷酸化提高约20°处衍射峰强度。这些结果共同说明磷酸化诱导了MPI构象展开与重排。
3.6 HIPE表征：以LMPI（5% STPP处理）制备HIPE。外观观察显示，在75%油相分数下，天然MPI和LMPI均能形成稳定凝胶状乳液；但在80%油相分数下，天然MPI出现明显相分离，而LMPI仍保持稳定。激光共聚焦显微镜（CLSM）显示LMPI稳定的乳液液滴更小、分布更均匀，并紧密堆积形成连续凝胶网络；液滴尺寸测试中，LMPI组D[3,2]由19.51 μm降至约11 μm，zeta电位绝对值由44.75 mV升至72–76 mV；界面吸附含量和吸附率显著高于天然MPI组；流变测试显示所有样品呈剪切变稀行为，且LMPI在80%油相分数下储能模量G′最高、频率依赖性最弱，说明其形成了更强的弹性凝胶网络。
3.7 磷酸化修饰机制：综合以上结果，研究人员提出磷酸化改性机制：磷酸基团引入增加MPI表面负电荷，增强静电排斥和水分子的相互作用；同时诱导蛋白质构象重排，使结构松散、疏水基团和游离巯基暴露，从而改善界面吸附能力。这些变化使磷酸化MPI能在油水界面形成更致密的保护层，与液滴间静电排斥协同作用，抑制液滴聚结，进而提高HIPE稳定性。
上述结果说明，磷酸化通过电荷增强和构象重排改善了MPI的溶解性和界面活性，是其稳定HIPE的关键。磷酸化后的MPI在油滴周围形成致密界面层，加上增强的静电排斥，促进了小液滴的紧密堆积和强凝胶网络的形成，赋予了HIPE更高的弹性和储存稳定性。这些发现与蛋白质结构调控对界面行为影响的一般规律一致。
本研究表明，磷酸化是改善MPI结构、理化及界面特性的有效策略。STPP和STMP均能减少聚集和粒径，同时提高MPI的绝对zeta电位、表面疏水性和溶解度，表明修饰后发生显著的构象重排。两种试剂中，STPP效果强于STMP，5% STPP处理综合性能最佳，这可能归因于STPP的线性多聚磷酸盐结构和更高磷酸化效率，将更多磷酸基团引入MPI，导致更高的表面电荷密度、更强静电排斥和更明显的结构松散化；而STMP作为环状偏磷酸盐，诱导的磷酸化和结构重排相对较弱。因此，磷酸化MPI（尤其是5% STPP-MPI）能在油滴周围形成更致密界面层，并在稳定HIPE方面表现出更优性能，表现为更小的液滴尺寸、更均匀的微观结构、更强凝胶特性和改善的视觉储存稳定性。总体而言，这些发现加深了对磷酸盐介导的坚果蛋白修饰的理解，并支持磷酸化MPI作为基于HIPE的食品体系中有前景的稳定剂。
