宏转录组学揭示传统发酵食品微生物组的代谢图景：方法学、证据层级与跨体系整合

《Current Research in Food Science》：Harnessing metatranscriptomics to unveil the metabolic landscape of microbiota in traditional fermented foods

　　

摘要专业翻译 传统发酵食品因其独特感官特性和潜在健康益处而被广泛消费和重视。这些食品含有复杂的微生物群落，其相互作用和代谢活动塑造了与产品质量、安全性和功能性相关的生化转化。宏转录组学（metatranscriptomics）提供了一种不依赖培养的群落RNA分析手段，可检测发酵过程中微生物基因表达的变化。然而，大多数发酵食品微生物组研究仍从群落组成或基因组潜力（genomic potential）推断功能，而非基于原位基因表达。现有宏转录组学应用在采样、RNA处理、测序和数据分析方面也存在显著差异，限制了不同食品体系间的可比性。本综述审视了应用于发酵食品的宏转录组学工作流程，包括样品制备、测序策略和生物信息学分析；识别了在复杂食品基质中进行可重复RNA研究所需的实践要求，并比较了不同发酵体系中转录水平呈现的分类群（transcriptionally represented taxa）和代谢通路。综述还区分了基因表达与实际代谢活性之间的差异——这是解读转录注释和重建通路时的重要边界。研究人员进一步评估了宏转录组学单独使用及与互补组学（complementary omics）联合使用时，在解析微生物群落结构-功能关系方面的优势与局限。关键挑战包括数据整合、证据解读以及从复杂转录组数据集中恢复生物学有意义的信息。当与互补组学及实验验证相结合时，宏转录组学有助于将表达基因和通路与发酵表型联系起来。这些见解可为发酵剂（starter cultures）的实验评估和更精准的发酵控制策略的开发提供指导。

论文解读

一、研究背景与问题

传统发酵食品历史悠久，不仅具有防腐功能，还能增强风味和营养价值，在全球范围内被广泛消费。这些食品中的复杂微生物群落在发酵过程中通过相互作用和代谢活动，塑造了与产品质量、安全性和功能性相关的生化转化。然而，发酵食品微生物群受地理、原料、加工方式和维护实践等多重因素影响，群落模式的可重复性识别面临困难。为确保产品质量和稳定性，需要全面理解核心微生物群以及影响发酵的关键生物和非生物因素。

现有微生物组分析方法中，宏基因组学（metagenomics）可表征群落组成和编码功能潜力，但无法反映条件依赖的基因表达；宏蛋白质组学（metaproteomics）可检测蛋白存在，但不能单独确立催化活性或通路通量；代谢组学（metabolomics）可测量底物和产物，但将代谢物归属于特定微生物分类群需要额外证据。宏转录组学（metatranscriptomics）通过分析群落RNA，能够提供发酵过程中微生物基因表达的时空特异性视图，弥补上述方法的不足。然而，RNA不稳定性、测序深度不足、参考基因组不完整以及成本问题持续限制其在发酵食品研究中的应用，导致其应用频率低于宏基因组学和代谢组学。此外，现有宏转录组学研究在采样、RNA处理、测序和数据分析方面差异显著，缺乏跨食品体系的系统比较和方法学共识。

二、研究内容与结论

本综述旨在填补这一空白，系统比较了应用于传统发酵食品的宏转录组学工作流程，包括样品制备、测序策略和生物信息学分析；识别了在复杂食品基质中进行可重复RNA研究的实践要求；比较了不同发酵体系中转录水平呈现的分类群和代谢通路；区分了基因表达与实际代谢活性之间的边界；评估了宏转录组学单独及联合互补组学在解析微生物群落结构-功能关系方面的优势与局限。研究指出，宏转录组学与互补组学及实验验证相结合时，有助于将表达基因和通路与发酵表型联系起来，可为发酵剂的实验评估和更精准的发酵控制策略开发提供指导。

三、关键技术方法

研究人员基于Web of Science核心合集（检索时间2009年至2026年8月2日）进行文献检索，共获取107条记录，使用VOSviewer 1.6.21进行关键词共现网络分析（最低出现阈值10次，最终纳入42个关键词，3个聚类簇，842条连线，总连接强度7,266）。综述系统比较了各研究中的RNA稳定化处理（液氮速冻、RNA稳定剂）、RNA提取策略（直接提取或细胞分离后提取）、rRNA去除方法（序列特异性捕获寡核苷酸、poly(A)富集等）、测序平台（Illumina短读长、PacBio HiFi长读长、Oxford Nanopore Technologies直接RNA测序）以及生物信息学分析流程（质量控制、宿主/基质RNA过滤、参考比对或从头组装、分类注释、功能注释、标准化与差异表达分析）。

四、研究结果

4.1 发酵果蔬

宏转录组学研究主要考察微生物演替和风味相关转录。泡菜相关乳酸菌（LAB）中检测到碳水化合物代谢和乳酸发酵相关转录本；四川泡菜发酵中检测到苯丙酮酸脱羧酶、草酰乙酸脱羧酶和乙醇脱氢酶等风味形成相关酶转录本，其中来自Lactobacillus vermolensis的酚酸脱羧酶（LvPAD）经异源表达验证具有最高催化活性和良好热稳定性。硫代谢方面，链球菌科（Streptococcaceae）相关转录本富集于硫代谢和含硫氨基酸降解通路，与硫化物挥发性化合物变化相关。食品安全方面，Lactiplantibacillus中注释到亚硝酸盐氧化还原酶（NxrAB），肠杆菌科（Enterobacteriaceae）中检测到亚硝酸还原酶基因nrfA和nirB的表达。

4.2 发酵大豆

研究关注风味和生物胺（biogenic amines, BAs）形成相关通路的表达。韩国传统酱油（Ganjang）发酵的整合宏基因组与宏转录组分析鉴定出16个候选生物胺脱羧酶基因，包括5个鸟氨酸脱羧酶（ODC）、1个赖氨酸脱羧酶（LDC）、1个组氨酸脱羧酶（HDC）和9个酪氨酸脱羧酶（TDC）。发酵早期，Bacillus和Halomonas相关的鸟氨酸脱羧酶转录本被检测到；发酵中期，Staphylococcus、Tetragenococcus等分类群的赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸和酪氨酸脱羧酶转录本被注释；发酵后期，Lactobacillus相关的鸟氨酸脱羧酶转录本显著呈现。这些结果将相应分类群鉴定为生物胺形成的候选贡献者。

4.3 酸面团

酸面团由乳酸菌和酵母菌的混合群落自然发酵产生。Weckx等人（2009）开发了靶向47种乳酸菌和4种非乳酸菌406个基因的功能基因微阵列，重点关注糖代谢、细菌素产生和外多糖生物合成相关基因。

4.4 发酵乳制品

酸马奶（koumiss）研究中，转录本以代谢过程相关为主，富集分析涉及核糖体功能、醚脂代谢、氨基苯甲酸降解、mRNA监视、类固醇生物合成和乙苯降解等通路。卡门贝尔型奶酪研究中，转录谱表明Geotrichum candidum参与与香气和氨形成相关的甲硫氨酸分解代谢，Penicillium camemberti具有更大的脂解潜力，三个酶被提出为候选成熟生物标志物。Reblochon风格奶酪研究中，两种酵母的氨基酸分解代谢转录本均上调，G. candidum较早（第14–35天）而Debaryomyces hansenii主要在35天；乳酸菌转录组在成熟期间变化较少。Vorarlberger Bergk?se研究中，Staphylococcus与早期成熟（第30天）相关，Brevibacterium和Corynebacterium在第90天与氨基酸和脂肪酸代谢及候选风味化合物通路相关。瑞士型Maasdam奶酪研究中，冷库成熟期间其他重建细菌的中心代谢转录本下降，而Lactococcus lactis保留或上调了同型乳酸发酵和维生素B₁、B₂生物合成相关转录本。开菲尔研究中，水开菲尔转录组在能量生产和膜转运方面呈现更高代表性，牛奶开菲尔转录组在翻译、核糖体生物发生、翻译后修饰和蛋白质折叠方面呈现更高代表性。

4.5 可可豆发酵

转录本注释提示Lactiplantibacillus plantarum在乳酸和甘露醇利用中的候选作用，Acetobacter pasteurianus在草酸降解中的候选作用，以及多个细菌分类群在果胶降解中的候选作用。

4.6 发酵酒精饮料

浓香型白酒研究中，Saccharomyces cerevisiae相关转录本突出，其他微生物可能从丙酮酸和乙酰辅酶A中间体参与乙醇形成。泸州风味白酒窖泥研究中，老化窖泥中碳水化合物和氨基酸代谢相关转录本（包括编码四种有机酸通路中八个酶的转录本）比退化窖泥中更丰富，老化窖泥中Methanoculleus、Thermosediminibacter和Methanosarcina相关信号占优。

五、讨论与结论

讨论部分强调，宏转录组学信号识别的是转录水平呈现的基因和通路，而非独立确立其功能实现。转录本丰度不一定对应蛋白丰度、酶活性、代谢通量或代谢物产量。宏转录组学不能独立确立核心群落成员、种群增长或代谢活性，需要互补的DNA、蛋白质、代谢物或表型水平证据。跨研究比较时，表观生物学差异不能总是与方案效应区分开来，因此需要基质特异性基准测试、过程对照、生物学重复和完整报告保留的微生物mRNA比例。当前没有单一RNA提取、rRNA去除或生物信息学流程可被视为适用于所有发酵食品基质的最优方案。结论部分指出，当与互补组学和实验验证相结合时，宏转录组学可以帮助将表达基因和通路与发酵表型联系起来，这些见解可为发酵剂的实验评估和更精准的发酵控制策略开发提供指导。