《Current Research in Microbial Sciences》：MrhbtA, a C?H?-type transcription factor, promotes hyphal branching and azaphilone biosynthesis in
Monascus ruber M7
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摘要：丝状真菌Monascus spp.可产生重要的次生代谢产物—azaphilone色素（MAs），广泛用于食品与化妆品工业。菌丝分枝形态与MAs生产力密切相关。本研究通过筛选随机T-DNA插入文库，在Monascus ruber M7中鉴定到一个新型C?H
摘要：丝状真菌Monascus spp.可产生重要的次生代谢产物—azaphilone色素（MAs），广泛用于食品与化妆品工业。菌丝分枝形态与MAs生产力密切相关。本研究通过筛选随机T-DNA插入文库，在Monascus ruber M7中鉴定到一个新型C?H?型锌指转录因子MrhbtA。研究人员构建了基因过表达（OE::mrhbtA）和基因敲除（ΔmrhbtA）菌株，测定了菌丝分枝和MAs产量。进一步采用DNA亲和纯化测序（DAP-seq）鉴定了MrhbtA的潜在直接靶基因。结果表明，MrhbtA正向调控菌丝分枝和MAs生物合成，并揭示了真菌形态发生与次生代谢之间的调控联系，为优化Monascus发酵提供了潜在遗传靶点。
论文解读：MrhbtA调控Monascus ruber M7菌丝分枝与azaphilone色素生物合成的多层级网络
一、研究背景与科学问题
丝状真菌因生产酶制剂、药物、有机酸等广泛用于工业。其中，Monascus spp.在东亚国家传统上用于食品发酵，其产生的重要次生代谢产物—azaphilone色素（MAs）被用作天然着色剂，全球超过20亿人每年消费含MAs的食品。菌丝形态与营养利用、生物量积累及色素生产力紧密相关，初级代谢和能量在菌丝内用于MAs合成。先前研究表明，过表达mpSTE1可使菌丝分枝增加63%、MAs产量提高30.1%，而敲除mpSTE1则使分枝减少68%并伴随生长和次生代谢下降；菌丝形态也与Monascus发酵中色素生产力密切关联。因此，解析菌丝分枝的调控机制对于优化Monascus发酵至关重要。但该过程的转录调控机制仍不清楚。C?H?型锌指转录因子是真菌中一类重要的序列特异性DNA结合调控因子，参与菌丝发育、细胞壁组织、胁迫适应及次生代谢，但它们在Monascus中连接菌丝形态发生与MAs生物合成的角色尚未阐明。
二、研究目标与主要结论
本研究旨在鉴定Monascus spp.中调控菌丝分枝和MAs生物合成的关键转录因子。研究人员通过筛选随机T-DNA插入文库，在M. ruber M7中鉴定到一个新型转录因子MrhbtA，并构建了基因过表达（OE::mrhbtA）、基因敲除（ΔmrhbtA）和回补（CΔmrhbtA）菌株，系统分析了菌丝分枝、孢子形成和MAs产量。结合DNA亲和纯化测序（DAP-seq）鉴定MrhbtA的直接结合靶基因。核心结论为：MrhbtA作为正调控因子促进菌丝分枝、有性与无性孢子形成以及胞外MAs合成，并通过多层级转录网络协调真菌发育与次生代谢。
三、主要技术方法
研究人员以M. ruber M7（中国普通微生物菌种保藏中心，CGMCC，保藏号25474）为野生型菌株。通过农杆菌介导的同源重组转化构建了ΔmrhbtA、OE::mrhbtA和CΔmrhbtA菌株；采用TAIL-PCR鉴定T-DNA插入位点；利用光学显微镜和扫描电子显微镜观察菌丝分枝、隔膜间距、菌丝直径及孢子结构；通过RT-qPCR验证基因转录水平；用UV分光光度法测定胞外和胞内黄、橙、红三种MAs在380、470、520 nm波长处的吸光度；采用DAP-seq在全基因组水平鉴定MrhbtA的靶基因，并使用MEME套件进行结合基序分析，KOG数据库进行功能分类。
四、主要研究结果
4.1 转录因子MrhbtA的鉴定
研究人员从先前构建的随机T-DNA插入文库中筛选到18个分枝缺陷突变体，TAIL-PCR鉴定出一个编码推定转录因子的基因被T-DNA破坏，命名为MrhbtA。系统发育分析表明MrhbtA与Aspergillus物种的同源蛋白聚为同一家族，其C?H?型锌指结构域与Aspergillus高度相似，提示其在Monascus属中为保守转录因子。
4.2 突变菌株的构建与验证
通过同源重组构建了ΔmrhbtA、OE::mrhbtA和CΔmrhbtA菌株。诊断PCR确认了预期基因型；RT-qPCR证实ΔmrhbtA中mrhbtA完全失活，OE::mrhbtA中mrhbtA转录水平约为野生型的12倍。多个独立转化株的表型趋势一致，各选取一个代表菌株进行详细分析。
4.3 缺失和过表达mrhbtA影响菌丝生长
ΔmrhbtA菌落直径显著减小、气生菌丝变短；OE::mrhbtA菌落稍大、气生菌丝长但分布稀疏。液体培养中，ΔmrhbtA菌丝球直径和干重分别较野生型降低约29%和22%，OE::mrhbtA分别增加10%和12%。回补菌株恢复至野生型水平，证明MrhbtA对菌丝发育和生长表型起关键作用。
4.4 MrhbtA促进菌丝分枝
显微观察显示，ΔmrhbtA每100 μm菌丝分枝数较野生型减少41%，OE::mrhbtA增加约40%；ΔmrhbtA隔膜间距增加42%，菌丝直径减少约0.91 μm，而OE::mrhbtA的隔膜间距和直径无显著变化。SEM和孢子萌发早期观察也支持MrhbtA对分枝的正向调控。回补菌株完全恢复这些形态缺陷，表明MrhbtA是菌丝正常形态发生所必需的。
4.5 MrhbtA促进有性和无性孢子形成
ΔmrhbtA在固体培养基上闭囊壳产生显著减少，分生孢子产量降低21.6%；OE::mrhbtA则闭囊壳明显增加，产孢量增加13.7%。液体发酵中趋势一致。回补菌株恢复至野生型水平，说明MrhbtA同时正向调控有性和无性产孢。
4.6 MrhbtA促进azaphilone色素生物合成
ΔmrhbtA胞外黄、橙、红MAs产量分别降低39.4%、53.6%和24.2%，OE::mrhbtA分别提高69.0%、11.8%和31.1%；胞内MAs水平无明显变化。RT-qPCR显示，mrhbtA缺失显著下调pigC、pigD、pigE、pigF、pigM、pigN、pigP表达并上调pigG、pigO；过表达则提高大多数MAs生物合成基因转录，其中pigB上调约6.2倍，而pigI被抑制至野生型的约10%。由于pigI编码推定转录抑制因子，MrhbtA可能通过激活生物合成基因并抑制负调控因子pigI来促进MAs合成。
4.7 DAP-seq揭示MrhbtA靶基因和调控网络
DAP-seq共鉴定出121个MrhbtA显著结合区域。KOG功能分类显示靶基因涉及糖代谢、细胞过程、遗传信息处理和环境信息处理，其中11个膜转运相关基因可能参与营养摄取和色素分泌。MEME分析得到四个富集结合基序：GATA样核心基序（5′-AGATAG-3′）、TATA盒样元件（5′-TATATA-3′）、bZIP/AP-1样序列（5′-TGAGTCA-3′）和CCAAT盒（5′-CCAAT-3′）。选取24个可能与分枝、产孢和MAs相关的靶基因进行RT-qPCR验证，发现它们在OE::mrhbtA中均显著上调。综合结果，研究人员提出MrhbtA作为中央调控因子，通过调控SKN7、PigB、Klf1、PBS2、Tup1等下游转录因子，进而控制细胞壁合成（如几丁质合酶基因CHS1、CHS8）、细胞周期、孢子形成和pigA–pigP基因簇，形成多层级网络。
五、讨论与结论
讨论部分指出，ΔmrhbtA菌株分枝减少的表型与Aspergillus fumigatus中zfpA缺失株相似，但由于缺乏ZfpA的全基因组结合数据，不能推断二者功能保守。隔膜间距增加提示细胞分裂受阻；Sac1（肌动蛋白合成相关基因）表达在ΔmrhbtA中降低、在OE::mrhbtA中升高，说明MrhbtA可能通过影响肌动蛋白合成和细胞壁重塑促进分枝。孢子形成方面，vosA和wetA可能为其下游靶点，与BrlA-AbaA通路协同调节孢子成熟和存活。STE12在Δ和OE菌株中均显著下调，表明MrhbtA剂量需平衡以确保STE12正常表达，且存在STE2介导的正反馈调控。DAP-seq还发现PBS2、HOG1、TPK1、WHI3、CLN1等细胞周期相关潜在靶标，但完整级联在Monascus中尚待验证。此外，DAP-seq本质为体外方法，无法模拟天然染色质环境和翻译后修饰，故所鉴定靶标属于潜在直接靶标，需谨慎解读。
结论：本研究鉴定并表征了MrhbtA——一种C?H?型锌指转录因子，在M. ruber M7中作为菌丝分枝、孢子形成和MAs产量的重要调控因子。ΔmrhbtA菌株表现出分枝减少、产孢受损和胞外MAs产量降低，而OE::mrhbtA菌株呈现相反趋势。DAP-seq鉴定出121个潜在直接靶基因，涉及细胞壁生物合成、细胞周期进程和MAs代谢。这些发现揭示了M. ruber中真菌发育与次生代谢之间的调控联系，并为提高Monascus MAs产量和发酵性能提供了潜在遗传靶点。
