Mdivi-1作为TLR2和TLR4的假想直接拮抗剂：一项带有可实验验证预测的多尺度计算研究

《Computational Biology and Chemistry》：Mdivi-1 as a Putative Direct Antagonist of TLR2 and TLR4: A Multiscale Computational Study with Experimentally Testable Predictions

　　

•计算预测显示 Mdivi-1 可与 TLR2 和 TLR4-MD-2 受体结合。
•分子动力学（MD）模拟显示其结构稳定性与已知参考配体相当。
•MM/PBSA 能量学分析确定 SER346 残基和一个苯丙氨酸三联体为结合位点。
•提出了可检验的假设以指导未来的体外生物物理验证。

Introduction
Toll 样受体（TLR）是基础的模式识别受体（PRR），通过检测病原体相关分子模式（PAMP）启动先天免疫反应。其中，TLR2 和 TLR4 是微生物脂质的主要传感器；TLR2（常与 TLR1 或 TLR6 形成异二聚体）识别脂肽，而 TLR4 在与髓样分化因子 2（MD-2）复合物中特异性识别脂多糖（LPS）(Akira and Takeda, 2004, Kawasaki and Kawai, 2014)。MD-2 是一种与 TLR4 胞外结构域非共价结合的分泌型糖蛋白，形成 LPS 识别的主要疏水口袋 (Park et al., 2009)。这种相互作用的结构性生物学已被精辟阐明。LPS 的五条脂质链深入插入 MD-2 的疏水腔体，诱导构象变化，使两个 TLR4-MD-2 异二聚体彼此靠近，从而触发细胞内信号传导 (Park et al., 2009, Jin et al., 2007)。这种功能不对称性——MD-2 充当配体结合传感器，TLR4 充当信号效应器——具有深远的药理学意义。MD-2 疏水口袋已成为 TLR4 拮抗的主要靶点节点，例如临床阶段的拮抗剂依利洛兰（Eritoran，E5564），它占据 MD-2 腔体以竞争性阻断 LPS 对接。虽然 TLR2 和 TLR4 对宿主防御至关重要，但其病理性过度激活与脓毒症、神经炎症和自身免疫性疾病密切相关 (Kuzmich et al., 2017)。因此，使用小分子竞争性阻断胞外结构域（ECD）或 MD-2 界面内的配体结合腔已成为缓解过度炎症的既定药理学策略 (Savva and Roger, 2013, Anwar et al., 2019)。

Mdivi-1（线粒体分裂抑制剂 1，图 1），一种喹唑啉酮衍生物，最初被发现并主要被认为是线粒体相关蛋白 1（Drp1）的选择性抑制剂，调节线粒体分裂 (Cassidy-Stone et al., 2008)。越来越多的证据表明，Mdivi-1 有效抑制了各种细胞和动物模型中的炎症反应 (Park et al., 2015, Wang et al., 2017)。主流共识将这些抗炎特性归因于间接的下游机制：通过抑制线粒体碎片化或调节复合物 I 活性，Mdivi-1 减少了活性氧（ROS）的产生，进而减弱了 TLR 信号通路中下游的 NF-κB 激活 (Bordt et al., 2017, Ruiz et al., 2018)。

值得注意的是，最近的文献越来越强调 Mdivi-1 的 Drp1 非依赖性活性，最突出的是其直接调节线粒体呼吸链复合物 I，表明其具有比最初假设更广泛的多药理学特征 (Ruiz et al., 2018)。鉴于这种日益增多的认识，其在细胞表面直接受体结合的可能性代表了一个未探索的前沿。虽然既定的特异性 TLR 拮抗剂（如用于 TLR2 的 CU-CPT22 和用于 TLR4 的 T5342126）表现出高结合亲和力，并有效占据这些受体的大型疏水通道 (Cheng et al., 2012, Shirey et al., 2013)，但严重全身性炎症的临床管理通常受益于干预复杂的多通路反馈回路。这凸显了探索 Mdivi-1 多药理学潜力的科学意义。

鉴于其喹唑啉酮核心的结构特征及其抗炎作用的快速起效，我们假设 Mdivi-1 可能提供独特的药理学优势。先前的实验报告显示，Mdivi-1 能在治疗后 30 至 60 分钟内抑制小胶质细胞中 LPS 诱导的 TNF-α和 IL-6 产生。这一时间范围难以与纯线粒体依赖机制相调和，后者通常需要通过转录调节数小时才能显现。这种时间差异提供了研究直接受体相互作用的间接动力。因此，我们提出了一种假设性的双层抑制模型。Mdivi-1 可能作为细胞表面的早期阶段“守门人”，通过直接占据 TLR2 和 TLR4 口袋发挥作用，同时作为细胞内的晚期阶段“调节器”，通过抑制 Drp1 介导的 ROS 产生发挥作用。探索这种未被认知的胞外靶向潜力可能为 Mdivi-1 的广谱抗炎功效提供新视角，使其区别于传统的单靶点分子。

然而，小分子化合物经常表现出多药理学特性，Mdivi-1 直接受体拮抗的可能性在很大程度上被忽视了。结构上，具有可比分子量和芳香骨架的小分子（如用于 TLR2 的 CU-CPT22 和用于 TLR4 的 L6H21，图 1）已通过晶体学和生化方法证明，通过占据这些受体的大型疏水通道作为空间位阻拮抗剂发挥作用 (Cheng et al., 2012, Shirey et al., 2013)。鉴于其喹唑啉酮核心的结构特征以及在某些检测中观察到的抗炎作用快速起效，我们提出了一个可计算检验的假设：Mdivi-1 是否不仅作为细胞内线粒体调节剂，还可能作为占据 TLR2 和 TLR4-MD-2 复合物胞外疏水口袋的潜在配体？

重要的是，这两种潜在机制——胞外受体结合和胞内线粒体调节——并不互斥。我们提出了一种假设性的双层抑制模型。Mdivi-1 可能作为细胞表面的早期阶段“守门人”，通过直接占据 TLR2/4 口袋发挥作用，同时作为细胞内的晚期阶段“调节器”，通过抑制 Drp1 介导的 ROS 产生发挥作用。这种协同机制可以解释先前研究中观察到的 Mdivi-1 快速起效和持续的抗炎作用，而单机制模型难以解释这一点。先前的实验报告显示，Mdivi-1 能在治疗后 30-60 分钟内抑制小胶质细胞中 LPS 诱导的 TNF-α和 IL-6 产生，这一时间范围难以与通常需要通过转录调节数小时才能显现的纯线粒体依赖机制相调和。这种时间差异提供了研究直接受体相互作用的间接但令人信服的动机。

由于这种直接结合假设缺乏明确的晶体学证据，在没有严格理论可行性评估的情况下启动纯体外结合测定容易受到伪影的影响。因此，本研究旨在利用多尺度计算生物学流程 (Meng et al., 2011) 系统评估该假设的生物物理和热力学可行性。通过整合分子对接、广泛的分子动力学（MD）模拟和分子力学/Poisson-Boltzmann 表面积（MM/PBSA）热力学，我们评估了假设复合物结构稳定性、别构动力学（PCA 和 DCCM）和能量轮廓。此外，采用包含分子静电势（MEP）、相互作用区域指示符（IRI）和前线分子轨道（FMO）分析的密度泛函理论（DFT）计算，为观察到的分子间相互作用提供了量子力学依据。

本研究的主要目标是阐明 Mdivi-1 是否具备必要的几何和电子相容性，以稳定地锚定在 TLR2 和 TLR4 信号轴中。验证这种假设性直接受体结合的理论可行性，不仅将为 Mdivi-1 的药理学多效性提供新视角，可能通过互补的胞外和胞内机制发挥作用，还将为基于喹唑啉酮支架理性设计广谱 TLR2/4 双靶点配体提供有价值的理论框架。此外，通过生成关于相对结合潜力、候选相互作用热点和理论上预测的受体动力学变化的可实验检验假设，我们旨在弥合计算发现与实验验证之间的差距，从而最大化本研究的转化影响力。

Section snippets
Molecular Preparation and Docking
TLR2 胞外结构域（PDB ID: 2Z7X）和 TLR4-MD-2 复合物（PDB ID: 3FXI）的初始三维结构从蛋白质数据库获取。这两种结构均代表配体结合构象（2Z7X 与 Pam3CSK4 结合；3FXI 与 LPS 结合），为拮抗剂对接提供了适当的结合位点几何形状。选择 3FXI（TLR4-MD-2-LPS 复合物）来定义对接网格在结构上是合理的。在该复合物中，LPS 的五条酰基链深深...

Positive Control Benchmarking and Binding Site Validation
为了验证结合口袋选择的准确性并建立有意义的计算基准，我们将已确立的抑制剂 CU-CPT22 和 T5342126 分别重新对接到 TLR2 和 TLR4 受体模型中。如图 2 所示，Mdivi-1 和已知的阳性对照配体在两种受体的疏水结合腔内占据几乎相同的位置。这种高度重叠的结合模式与药效团位置完全一致...

Limitations and Future Directions
虽然我们的多尺度计算方法提供了支持直接拮抗假设的连贯理论框架，但应承认一些局限性，以提供平衡的视角并指导未来的改进。
首先，我们的 MD 模拟在环境设置和构象采样方面存在局限性。模拟是在显式水溶剂中进行的，没有脂质膜。我们承认，虽然这种简化的水模型是...

Conclusion
总之，本研究通过全面的计算生物学流程，系统评估了 Mdivi-1 可能作为 TLR2 和 TLR4 信号轴计算预测配体的假设。经典分子动力学模拟表明，Mdivi-1 能够在两种受体的疏水口袋内保持稳定的结合姿态。几何稳定性指标结合 PCA 和 FEL 评估显示，配体的存在...

Data Availability
支持本研究结果的所有相关数据均可在本文及其补充材料中获取。

Funding
感谢中国国家博士后科学基金 fellowship（2025M772890）、中国国家博士后科学基金博士后 fellowship 项目（GZC20251904）、北京博士后研究资助（2025-zz-19）、朝阳区博士后研究资助（2025ZZ-12）和北京市属高校基本科研业务费（055000546325505）的资金支持。

CRediT authorship contribution statement
Haonian Jin：验证，资源。Peng Jiao：撰写——初稿，方法论，数据管理，概念构思。Huijie Han：验证，项目管理，资金支持获取。Xiaokun Zhang：可视化，软件。Hong Yan：验证，项目管理，资金支持获取。

Conflict of Interest
作者声明无利益冲突。

Declaration of Competing interest
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文所报告的工作。

Peng Jiao|Haonian Jin|Xiaokun Zhang|Huijie Han|Hong Yan