一种新型CD123×Vδ2双特异性T细胞连接蛋白可诱导具有强大活性和肿瘤选择性的Vγ9Vδ2-T细胞活性，对抗CD123阳性的急性髓系白血病和骨髓增生异常综合征

《Clinical Immunology》：A novel CD123xVδ2 bispecific T cell engager induces potent and tumor selective Vγ9Vδ2-T cell activity against CD123 expressing acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome

　　

# 摘要

急性髓系白血病（AML）和高风险骨髓增生异常综合征（MDS）预后不良。我们开发了一种人源化、半衰期延长的CD123×Vδ2双特异性T细胞衔接器（bsTCE），用于将Vγ9Vδ2 T细胞重定向至CD123阳性恶性肿瘤。该衔接器选择性结合Vγ9Vδ2 T细胞和CD123阳性AML细胞，在特异性和组织交叉反应性试验中未检测到脱靶相互作用。在体外，它诱导了对肿瘤细胞系和患者来源的AML和MDS细胞的强效溶解作用，包括在低效应细胞与靶细胞比率下，支持连续杀伤。与CD123×CD3 bsTCE相比，它诱导的与细胞因子释放综合征相关的细胞因子水平较低。Vγ9Vδ2 T细胞优先溶解肿瘤细胞而非CD123阳性的非恶性细胞，包括浆样树突状细胞，并且在患者的外周血和骨髓中可检测到。该衔接器在AML异种移植模型中减少了肿瘤生长，并在非人灵长类动物中表现出抗体样药代动力学。一项I期临床试验已启动（ACTRN12624001214527）。

# 引言

骨髓栖息造血干细胞区室，成熟的淋巴系和髓系细胞起源于此。急性髓系白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）是影响该干细胞区室的恶性肿瘤，从而严重影响（髓系细胞）造血。

AML是成人中最常见的急性白血病形式，其特征是未成熟髓系祖细胞的克隆性扩增。AML的主要治疗是使用蒽环类药物（如柔红霉素）和胞苷阿糖胞苷的强化化疗方案，通常随后进行造血干细胞移植（HSCT）。近年来，小分子靶向治疗，如FLT3和IDH抑制剂已被纳入临床实践[1]。尽管这些新型治疗选择被引入，5年总生存率（OS）仍然很低。对于60岁以下的成人，该OS率约为60%，而对于60-70岁的患者，这一数字降至20%，对于70岁及以上的患者，则低于5%[2]。

MDS是一组骨髓疾病，可导致骨髓异常、贫血、中性粒细胞减少和血小板减少。MDS可根据转化为AML的可能性被分为低危、中危或高危，这种情况发生在约三分之一的患者中。低危和高危MDS的治疗策略显著不同。低危MDS治疗侧重于症状管理，例如使用促红细胞生成素，而高危MDS需要更积极的方法，包括使用去甲基化剂或造血干细胞移植。与AML类似，MDS患者的OS仍然较差，5年OS率为27.0-45.6%[3]。尽管AML和MDS是不同的恶性肿瘤，具有不同的亚型，但它们共享许多遗传异常，包括t(8,21)(q22;q22)和inv.(16)(p13q22)。此外，两种疾病都表达髓系细胞表面抗原，如CD33、CD70、CLL1和CD123[4]、[5]、[6]。这些抗原中的几种已在临床试验中通过免疫治疗药物进行靶向，包括CD33[7]、CD70[8]、NKG2D配体[9]、CLL-1[10]和CD123[11]。

CD123是白细胞介素3受体α链（IL-3Rα，Uniprot P26951），表达于CD34+造血干细胞[12]。其表达在巨核细胞和红细胞分化过程中丧失[13]，但在粒细胞和单核细胞系分化和成熟过程中得以维持[14]。因此，该抗原在成熟的健康细胞上表达，例如嗜碱性粒细胞和浆样树突状细胞（pDC）[15]、[16]。已报告45-95%的AML病例中AML原始细胞过度表达CD123，并与NPM1和FLT3突变相关[17]、[18]。它还被发现与OS降低和缺乏临床缓解相关[19]，并显示可增强AML原始细胞增殖和存活。此外，IL-3信号传导增加会下调基质细胞来源的趋化因子-1（SDF-1）及其受体CXCR4，导致AML细胞从骨髓外迁[20]、[21]。

由于CD123在AML和MDS原始细胞上的高频表达，以及在白血病干细胞上的表达[5]、[22]、[23]，该抗原被认为具有靶向治疗的前景。Tagraxofusp（Elzonris）是唯一获批的直接靶向CD123的治疗药物，由截短的白喉毒素与白细胞介素-3融合而成。在浆样树突状细胞肿瘤患者中，tagraxofusp在前线治疗中达到了90%的总反应率，在复发或难治性疾病患者中达到了67%。然而，治疗与不同程度的毛细血管渗漏综合征相关，这是一种潜在的危及生命的不良事件，需要密切的临床监测和及时处理[24]。除tagraxofusp外，还有几种靶向CD123的治疗药物正在开发中或已用于治疗AML[25]、[26]、[27]，包括靶向CD123的嵌合抗原受体（CAR）T细胞和CD123×CD3双特异性T细胞衔接器（bsTCE）[7]、[28]、[29]、[30]。CD3结合bsTCEs在其他血液恶性肿瘤中获得了令人印象深刻的临床结果，包括在B细胞急性淋巴细胞白血病中的blinatumomab（CD19×CD3）[31]，在多发性骨髓瘤中的teclistamab和elranatamab（BCMA×CD3），以及talquetamab（GPRC5D×CD3）[32]、[33]、[34]，以及在滤泡性淋巴瘤中的mosunetuzumab、epcoritamab和glofitamab（CD20×CD3）[35]、[36]、[37]。然而，CD3结合bsTCE可能存在显著缺点，例如由于（严重）CRS导致的安全性欠佳，靶向肿瘤外毒性，以及CD3+调节性T细胞的激活，从而降低疗效并缩窄治疗窗口。当靶向在正常组织/细胞类型上表达的抗原（如CD123）时，这些缺点可能尤为值得关注。

利用固有样T细胞，如Vγ9Vδ2 T细胞，可能构成一种具有吸引力的治疗方案，可以更好地平衡毒性和治疗效果。Vγ9Vδ2 T细胞是一种保守的T细胞亚群，约占外周血中所有T细胞的1-5%，已被证明能够以人类白细胞抗原（HLA）-肽非依赖方式诱导对广泛恶性肿瘤细胞的细胞毒性[38]、[39]、[40]、[41]。Vγ9Vδ2 T细胞识别膜表达的蛋白质复合物，该复合物含有脂联素2A1（BTN2A1）和BTN3A1，当细胞内磷酸抗原积累并结合到BTN3A1胞质B30.2结构域时，会触发该复合物的构象变化[42]、[43]、[44]。除了T细胞受体（TCR）信号传导外，Vγ9Vδ2 T细胞激活还受到共受体信号传导（如NKG2D、DNAM-1）的调节。激活后，Vγ9Vδ2 T细胞群体可以大大扩增，产生促炎细胞因子和趋化因子，并通过直接溶解肿瘤细胞发挥靶细胞细胞毒性。此外，激活的群体可以通过细胞因子介导的下游激活固有免疫细胞（如自然杀伤（NK）细胞）和适应性免疫细胞（包括常规αβ T细胞）发挥间接治疗效果[45]、[46]。重要的是，激活的Vγ9Vδ2 T细胞可以获取、加工和呈递抗原，使它们能够启动和刺激适应性免疫反应[47]。与这些特征一致，Vγ9Vδ2 T细胞在血液肿瘤和实体瘤中的存在与良好预后相关[48]、[49]。此外，近期对初诊AML患者的一项研究表明，诊断时Vγ9Vδ2 T细胞频率较低的患者，其5年总生存和复发-free生存显著较低[50]。以前试图利用Vγ9Vδ2 T细胞治疗癌症的临床尝试已经证明了总体良好的安全性和在多个病例中诱导客观抗肿瘤反应[51]、[52]、[53]。此外，在AML的背景下，基于Vγ9Vδ2 T细胞的策略显示出前景：评估体外扩增的异基因Vγ9Vδ2 T细胞过继性转移的临床研究，在HSCT后和复发/难治性环境中均显示了客观反应（[54]、[55]和NCT05358808）。一项使用Vγ9Vδ2 T细胞激活单抗ICT01联合维奈托克和阿扎胞苷的临床研究[56]显示出有意义的临床活性，90%达到完全反应/伴有不完全血液学恢复的完全反应，且无剂量限制性毒性[56]。然而，由Vγ9Vδ2 T细胞介导的强烈且具有临床稳健性的反应迄今为止仍然少见，需要开发新的且更有影响力的方法。为进一步改善Vγ9Vδ2 T细胞基于治疗的疗效和一致性，下一代方法旨在通过使用bsTCE方法或使用基因工程改造的异基因γδ T细胞产品（包括CAR-γδ T细胞和TCR转导的αβ T细胞）更特异性地在肿瘤部位募集和激活Vγ9Vδ2 T细胞，以增强肿瘤细胞识别和治疗效力[57]、[58]、[59]。总之，这些创新可能为利用Vγ9Vδ2 T细胞的固有优势，开发新型、有效且安全的癌症治疗方案铺平道路。

在此，我们报告了一种CD123×Vδ2 bsTCE的生成和开发，该衔接器可在体外、离体和在体小鼠实验中诱导Vγ9Vδ2 T细胞介导的高效溶解CD123阳性肿瘤细胞。重要的是，由CD123×Vδ2 bsTCE结合的Vγ9Vδ2 T细胞对非恶性CD123阳性细胞（包括pDC、嗜碱性粒细胞和内皮细胞）仅表现出有限的反应性。在PBMC中激活Vγ9Vδ2 T细胞仅产生有限的细胞因子释放，与CD123×CD3 bsTCE诱导的相比，提示具有改善安全性的潜力。这些数据为启动针对AML和高风险MDS患者的I期临床试验奠定了基础（ACTRN12624001214527）。

# 段落摘要

**CD123特异性VHH和CD123×Vδ2双特异性VHH的生成**

为生成CD123特异性单域抗体（重链抗体重链可变域（VHH）），用CD123表达的C1R细胞[60]免疫了两只羊驼（Llama glama）。根据已发表的方法[61]，从免疫动物的外周血淋巴细胞（PBL）中生成了VHH"免疫"噬菌体文库。使用包被重组人（rh）CD123细胞外域（ECD，Sino Biological，北京，中国）进行了两轮噬菌体筛选。

**CD123特异性VHHs和CD123×Vδ2双特异性T细胞衔接器的生成**

为开发一种针对Vγ9Vδ2 T细胞和CD123的新型双特异性T细胞衔接器（bsTCE），我们首先生成了新的CD123结合抗体片段（重链抗体重链可变域，即VHH），以与先前确定的Vδ2-TCR特异性VHH克隆5C8[57]联合使用。为生成CD123结合VHH，用CD123表达的C1R细胞免疫了两只羊驼（Llama glama），然后从……

# 讨论

急性髓系白血病（AML）和高风险骨髓增生异常综合征（MDS）是预后不良的侵袭性血液恶性肿瘤。尽管AML和MDS是不同的临床实体，但它们共享几种表面抗原，包括CD123，可用于靶向免疫治疗。CD123，白细胞介素-3受体的α链，是AML和MDS恶性肿瘤原始细胞上过度表达的经过验证的肿瘤相关抗原，目前正被用作……

# CRediT作者贡献声明

Jurjen M. Ruben：原创草稿撰写，监督，数据整理。Charlotte M. Mousset：原创草稿撰写，形式分析，数据整理。Dorien van de Berg：调查，形式分析。Kim Hofman：调查，形式分析。Milon de Jong：调查，形式分析。Patricia Brouwer：调查，形式分析。Sanne Graeve：调查，形式分析。Victoria Iglesias-Guimarais：监督，数据整理。Pauline M. van Helden：监督。Anton E.P. Adang：……

# 资金

本研究由LAVA Therapeutics NV，荷兰乌得勒支提供资助。

Jurjen M. Ruben | Charlotte M. Mousset | Dorien van de Berg | Kim Hofman | Milon de Jong | Patricia Brouwer | Sanne Graeve | Victoria Iglesias-Guimarais | Pauline M. van Helden | Anton E.P. Adang | Rob C. Roovers | Hans J. van der Vliet