硬膜外脊髓电刺激通过PI3K/AKT/mTOR信号通路促进大鼠脊髓损伤后内源性神经干细胞扩增与神经保护

《Brain Research Bulletin》：Epidural Spinal Cord Stimulation Promotes the Expansion of Endogenous Neural Stem Cells and Neuroprotection via the PI3K/AKT/ mTOR Pathway after Spinal Cord Injury in Rats

　　

：脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）后的运动与感觉功能障碍严重影响患者生活质量。目前，SCI的治疗主要包括手术减压、大剂量类固醇治疗、并发症对症治疗及伤后康复以促进脊髓功能恢复，但疗效不尽如人意。尽管SCI已被广泛研究，迄今仍无有效的临床治疗方法。越来越多的证据表明，硬膜外脊髓电刺激（epidural spinal cord stimulation, ESCS）不仅能有效缓解躯干和肢体的神经病理性疼痛，还能显著改善动物模型及人类患者SCI后的运动功能。然而，ESCS在SCI后是否影响内源性神经干细胞（endogenous neural stem cells, eNSCs）的扩增及脊髓前角神经元存活尚不清楚。本研究旨在探讨ESCS通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对大鼠SCI后eNSC扩增和脊髓前角神经保护的作用。研究人员建立大鼠不完全挫伤性SCI模型，将大鼠随机分为假手术组（Sham）、SCI组、ESCS组和ESCS+LY294002（ESCS+LY）组，ESCS组及ESCS+LY组于术后连续7天接受阈下硬膜外电刺激（频率50 Hz，脉宽200 μs，强度0.045 mA）。通过BBB评分评估后肢运动功能，采用Nissl染色检测脊髓前角存活神经元数量，运用Western blot和免疫荧光双标检测eNSC标志物（nestin、sox2）表达及PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化水平，并通过TUNEL染色和cleaved-caspase-3检测前角细胞凋亡。研究结果表明，ESCS显著改善SCI后7天和28天大鼠后肢运动功能，增加脊髓前角存活神经元数量，促进eNSC扩增，上调p-Akt和p-mTOR表达水平，并抑制前角细胞凋亡；而PI3K抑制剂LY294002可部分逆转ESCS的上述效应。此外，ESCS可在SCI后28天诱导少量sox2表达神经元样细胞出现。综上所述，ESCS通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进eNSC扩增并发挥神经保护作用，为基于ESCS的SCI运动功能康复策略提供了机制依据。

论文解读

一、研究背景与科学问题

脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是导致运动与感觉功能障碍的严重神经系统疾病，严重影响患者生活质量。目前临床治疗手段主要包括手术减压、大剂量类固醇治疗、并发症对症处理及伤后康复训练，但总体疗效尚不理想，迄今缺乏有效的临床治疗方案。近年来，硬膜外脊髓电刺激（epidural spinal cord stimulation, ESCS）作为一种神经调控技术，在动物模型和临床患者中均显示出改善SCI后运动功能的潜力。既往研究认为ESCS主要通过功能性重构残留的下行传导通路促进运动恢复，但脊髓组织的解剖学重塑是否参与其中尚不清楚。研究团队前期工作已证实ESCS可促进少突胶质细胞存活与分化、保护髓鞘并改善运动功能，然而ESCS是否影响内源性神经干细胞（endogenous neural stem cells, eNSCs）的扩增以及脊髓前角运动神经元的存活，此前未见报道。

内源性神经干细胞（eNSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的神经干细胞，分布于脊髓中央管室管膜区、前角、后角及白质等区域。SCI后eNSCs可被激活并增殖，但主要分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞而非神经元，难以完全修复受损脊髓组织。因此，诱导eNSC增殖与定向分化被视为促进SCI后神经功能恢复的重要策略。已有研究表明，电刺激可促进eNSC增殖和分化，而PI3K/Akt/mTOR信号通路是调控神经干细胞增殖、分化和迁移的关键通路。基于此，本研究旨在探讨ESCS是否通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进eNSC扩增并发挥神经保护作用。

二、研究内容与主要结论

该研究以成年雌性Sprague–Dawley大鼠为实验对象，建立T10不完全挫伤性SCI模型，将大鼠随机分为四组：假手术组（Sham）、SCI组、ESCS组和ESCS+LY294002（ESCS+LY，PI3K选择性抑制剂）组。ESCS组和ESCS+LY组于术后连续7天接受阈下硬膜外电刺激（频率50 Hz，脉宽200 μs，强度0.045 mA，即运动阈值的90%）。研究通过BBB评分评估后肢运动功能，Nissl染色检测脊髓前角存活神经元，Western blot和免疫荧光检测eNSC标志物（nestin、sox2）及PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化水平，TUNEL染色和cleaved-caspase-3检测前角细胞凋亡。

研究得出以下核心结论：ESCS显著改善SCI后7天和28天大鼠后肢运动功能，增加脊髓前角存活神经元数量，促进eNSC扩增，上调p-Akt和p-mTOR表达水平，并抑制前角细胞凋亡；PI3K抑制剂LY294002可部分逆转ESCS的上述效应，表明ESCS通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥作用。此外，ESCS可在SCI后28天诱导少量sox2/NeuN双阳性神经元样细胞出现。该研究首次证实ESCS可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进eNSC扩增并发挥神经保护作用，为ESCS治疗SCI的机制研究提供了新的理论依据，也为将ESCS与靶向eNSC可塑性的联合治疗策略提供了科学基础。

三、主要关键技术方法

该研究采用以下关键技术方法：（1）大鼠T10不完全挫伤性SCI模型建立与硬膜外双触点芯片电极植入术，电极由华中科技大学控制科学与工程系自主研发，采用柔性印刷电路技术制备，阳极置于T10损伤中心，阴极置于T13节段；（2）阈下硬膜外电刺激干预，以假手术大鼠测定的运动阈值（0.05±0.009 mA）的90%（0.045 mA）作为刺激强度，频率50 Hz、脉宽200 μs，每天30分钟，连续7天；（3）BBB评分评估后肢运动功能；（4）Western blot检测nestin、sox2、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR及cleaved-caspase-3蛋白表达；（5）免疫荧光单标和双标染色检测eNSC标志物共定位及p-Akt、p-mTOR表达；（6）Nissl染色计数脊髓前角存活运动神经元；（7）TUNEL荧光染色检测前角细胞凋亡。实验动物由锦州医科大学实验动物中心提供，所有实验方案经锦州医科大学机构动物护理和使用委员会批准。

四、研究结果

1. 1.
   ESCS在SCI后7天和28天减轻大鼠后肢运动功能障碍

BBB评分结果显示，与Sham组相比，SCI组在伤后7天和28天BBB评分显著降低；与SCI组相比，ESCS组BBB评分显著升高；与ESCS组相比，ESCS+LY组BBB评分显著降低。结果表明ESCS可改善SCI后大鼠后肢运动功能。

1. 2.
   ESCS在SCI后7天和28天增加脊髓前角存活神经元数量

Nissl染色结果显示，SCI组脊髓前角存活神经元数量较Sham组显著减少，ESCS组存活神经元数量较SCI组显著增加。结果表明ESCS可促进SCI后脊髓前角神经元的存活。

1. 3.
   ESCS在SCI后7天增加大鼠脊髓nestin和sox2蛋白表达

Western blot结果显示，SCI组nestin和sox2蛋白表达较Sham组显著升高，表明SCI可诱导eNSC增殖；ESCS组nestin和sox2表达较SCI组进一步升高；ESCS+LY组较ESCS组显著降低。结果表明ESCS可促进SCI后eNSC扩增，且该效应可能通过激活PI3K/AKT信号通路实现。

1. 4.
   ESCS在SCI后7天促进脊髓eNSC扩增

免疫荧光双标（nestin/sox2/DAPI）结果显示，SCI组在脊髓中央管、前角、后角及白质区域的nestin平均荧光强度、sox2阳性细胞比例及eNSC（nestin/sox2双阳性）比例较Sham组显著增加，其中中央管和后角区域分布尤为明显；ESCS组上述指标较SCI组进一步升高；ESCS+LY组较ESCS组显著降低。结果表明ESCS可促进SCI后eNSC的扩增。

1. 5.
   ESCS在SCI后28天诱导sox2表达神经元样细胞

NeuN/sox2/DAPI三重免疫荧光标记结果显示，Sham组和SCI组均未观察到NeuN/sox2双阳性细胞；ESCS组和ESCS+LY组在脊髓前角出现少量sox2表达神经元样细胞，两组间无显著差异。结果表明ESCS可诱导SCI后sox2表达神经元样细胞的出现。

1. 6.
   ESCS在SCI后7天激活PI3K/Akt/mTOR信号通路

Western blot结果显示，SCI组p-Akt和p-mTOR蛋白水平较Sham组显著降低，表明SCI后PI3K/Akt/mTOR信号通路受抑制；ESCS组p-Akt和p-mTOR水平较SCI组显著升高；ESCS+LY组较ESCS组显著降低。免疫荧光染色结果与Western blot结果一致。结果表明ESCS可激活SCI后PI3K/Akt/mTOR信号通路。

1. 7.
   ESCS在SCI后28天抑制脊髓前角细胞凋亡

Western blot结果显示，SCI组cleaved-caspase-3蛋白水平较Sham组显著升高；与SCI组相比，仅植入电极但未施加电刺激的SCIE组无显著变化，而ESCS组显著降低，且ESCS组显著低于SCIE组。TUNEL染色结果显示，SCI组前角凋亡细胞比例较Sham组显著升高，ESCS组较SCI组显著降低，SCIE组无显著变化，ESCS组显著低于SCIE组。结果表明ESCS可抑制SCI后脊髓前角细胞凋亡，且该效应依赖于电刺激本身而非电极植入。

五、讨论与结论

讨论部分指出，ESCS的治疗效果取决于精确的电流递送，本研究采用三触点双极电极设计，阳极置于T10损伤节段、阴极置于T12节段，以减少电流扩散。阈下ESCS（运动阈值的90%）可促进SCI后大鼠自主运动活动恢复。eNSC增殖在SCI后7天达到峰值，ESCS可进一步促进eNSC扩增，尤其在中央管和后角区域。ESCS诱导的少量sox2表达神经元样细胞可能来源于eNSC分化、神经元去分化或胶质细胞转分化，其确切来源尚需进一步研究。ESCS主要通过抑制凋亡而非增加新生神经元数量来促进前角神经元存活。PI3K/Akt/mTOR信号通路在SCI后被抑制，ESCS可显著激活该通路，而LY294002可部分逆转ESCS的效应，证实ESCS通过激活PI3K/Akt/mTOR通路促进eNSC扩增。ESCS还可能通过抑制Notch信号通路间接促进eNSC扩增。关于ESCS激活PI3K的上游机制，研究提出四种假说：电刺激诱导神经元去极化释放神经递质和神经营养因子激活PI3K；电刺激或机械牵张激活整合素/FAK信号轴；电刺激调节细胞内钙浓度；电刺激调节转录因子变化间接解除对PI3K/AKT/mTOR通路的抑制。研究结论为：ESCS通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路促进eNSC扩增并发挥神经保护作用，为基于ESCS的SCI运动功能康复提供了机制依据，并提示将ESCS与靶向eNSC可塑性的联合治疗策略具有潜在应用价值。