《Brain Research Bulletin》：Apelin-13 exerts neuroprotection through activation of APJ/mTORC2 axis in microglia after Intracerebral Hemorrhage in mice
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脑出血（Intracerebral Hemorrhage, ICH）是一种严重的脑血管疾病，继发性脑损伤中的神经炎症在其病理进程中起关键作用。小胶质细胞作为中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的主要免疫效应细胞，其M1/M2表
脑出血（Intracerebral Hemorrhage, ICH）是一种严重的脑血管疾病，继发性脑损伤中的神经炎症在其病理进程中起关键作用。小胶质细胞作为中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的主要免疫效应细胞，其M1/M2表型极化平衡对ICH后的组织修复至关重要。Apelin-13是Apelin/APJ系统中最具受体亲和力的生物活性短肽异构体，已被证实具有抗氧化、抗凋亡及抗炎作用，但其在ICH后小胶质细胞调控中的具体生物学功能及分子机制尚不清楚。本研究采用自体血注射法建立小鼠ICH模型，通过免疫荧光染色、蛋白质印迹（Western blot）、实时定量聚合酶链式反应（quantitative PCR, qPCR）、TUNEL凋亡检测、脑含水量测定及神经行为学评估等手段，系统研究了Apelin-13/APJ/mTORC2信号轴在ICH后小胶质细胞极化调控中的作用。研究结果显示：ICH后Apelin-13及其受体APJ表达均显著上调，其中Apelin-13主要定位于神经元，而APJ主要表达于小胶质细胞；外源性重组Apelin-13（recombinant Apelin-13, rApelin-13）以剂量依赖方式减轻神经功能缺损、降低脑水肿并抑制神经元凋亡；rApelin-13通过激活APJ/mTORC2/Akt信号轴促进小胶质细胞向M2样抗炎表型极化；药理学抑制APJ或mTORC2，或小胶质细胞特异性敲低Rictor（mTORC2关键组分），均可完全消除rApelin-13的神经保护效应；体外实验进一步证实rApelin-13直接作用于小胶质细胞，经由APJ/mTORC2通路上调M2标志物表达。综上，本研究表明Apelin-13通过激活小胶质细胞APJ/mTORC2轴促进M2样极化，从而在ICH后发挥神经保护作用，为靶向小胶质细胞极化的早期ICH临床治疗策略提供了新的理论依据。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
脑出血（Intracerebral Hemorrhage, ICH）是常见的重症脑血管疾病，约占全部脑卒中的15%–20%，具有极高的致死率和致残率。据估计，全球每年新发ICH病例约200万例，其中亚洲地区发病率高达20%–30%，严重威胁人类健康。尽管外科手术技术不断进步，但针对ICH原发性脑损伤的手术干预对改善患者长期预后的效果仍然有限。越来越多的证据表明，ICH后继发性损伤是导致神经元丢失的重要原因，而神经炎症在其中发挥核心作用。因此，抗炎治疗被认为是ICH发病后颇具前景的治疗策略。
小胶质细胞作为中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）的主要免疫效应细胞，在损伤后神经炎症的介导中起关键作用。脑损伤后，炎症最初由M1型极化的小胶质细胞驱动，其释放白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）等细胞因子，导致细胞外基质破坏、细胞完整性受损及血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）功能障碍。ICH发病后7天内，小胶质细胞表型由M1向M2转变，这一转变对于血肿清除、组织愈合和炎症消退至关重要。因此，阐明ICH后脑内M2型小胶质细胞浸润的调控机制具有重要的科学意义。
APJ是一种经典的A类G蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptor, GPCR），在Apelin-13刺激下可激活多种G蛋白亚型，从而介导广泛的细胞反应。Apelin肽家族包含多种生物活性异构体，其中Apelin-13对APJ具有最高的受体亲和力。Apelin/APJ系统已被证实具有抗炎特性，并在蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage, SAH）后表现出减轻早期神经炎症和保护作用。然而，Apelin-13/APJ在ICH后小胶质细胞调控中的生物学功能及其潜在机制尚未被系统研究。基于此，研究人员提出假设：Apelin-13通过APJ/mTORC2轴特异性作用于小胶质细胞，在ICH后发挥神经保护作用。
二、主要技术方法
本研究采用雄性C57BL/6小鼠（8–10周龄，25–30g，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，南京）建立ICH模型，通过立体定位注射自体全血至右侧基底节区诱导ICH。主要关键技术方法包括：免疫荧光染色用于检测Apelin-13与APJ的细胞定位及小胶质细胞形态学分析；蛋白质印迹（Western blot）用于检测相关蛋白表达及磷酸化水平；实时定量聚合酶链式反应（quantitative PCR, qPCR）用于检测M2样标志基因mRNA表达；TUNEL染色用于检测神经元凋亡；脑含水量测定用于评估脑水肿程度；改良Garcia评分、肢体放置实验和转角实验用于评估短期神经行为功能；采用小胶质细胞特异性AAV-CD68-shRictor脑室内注射实现Rictor（mTORC2关键组分的编码基因）的靶向敲低；体外实验使用小鼠小胶质细胞BV2细胞系（购自武汉普诺赛生命科技有限公司）验证信号通路机制。
三、研究结果
3.1 ICH后APJ与Apelin的表达及定位
免疫荧光分析显示，ICH后Apelin-13主要表达于神经元，而其受体APJ主要定位于小胶质细胞。蛋白质印迹结果显示，ICH后内源性Apelin-13和APJ水平在12小时显著升高，24小时达到峰值，第7天逐渐下降。免疫荧光共定位分析进一步证实，ICH组Apelin-13与神经元标志物NeuN的重叠显著高于假手术组，APJ与小胶质细胞标志物Iba-1的共定位信号在ICH组也明显增强。此外，脑脊液中Apelin-13浓度在ICH后呈时间依赖性升高，24小时达到峰值。
3.2 rApelin-13在ICH后的神经保护作用
研究人员在ICH诱导后30分钟经鼻内给予不同剂量（10、30、60 μg/kg）的重组Apelin-13（recombinant Apelin-13, rApelin-13）。结果显示，rApelin-13治疗以剂量依赖方式显著缩小纹状体血肿体积；其中30 μg/kg剂量在24小时和72小时均最有效地改善神经行为功能。脑含水量（Brain Water Content, BWC）检测显示，ICH后同侧半球脑水肿显著增加，而rApelin-13给药显著减轻了这一变化。TUNEL染色表明，rApelin-13治疗显著减少了同侧皮层TUNEL阳性神经元数量，表明其具有抑制神经元凋亡的作用。
3.3 rApelin-13诱导小胶质细胞形态学及表型转变
研究人员利用ImageJ插件对小胶质细胞进行骨架化分析，定量评估分支数量、端点数和突起长度。结果显示，ICH诱导后小胶质细胞分支减少、端点减少、突起长度缩短，而rApelin-13治疗可逆转这些形态学改变。同时，ICH后M2样小胶质细胞相关基因（CD301、MRC1、ARG1）的mRNA水平较假手术组显著降低，rApelin-13给药以剂量依赖方式逆转了这一降低。这些发现表明，rApelin-13促进ICH后小胶质细胞向M2样抗炎表型转变。
3.4 APJ/mTORC2轴介导M2极化的促进作用
为验证APJ/mTORC2信号轴的作用，研究人员使用APJ拮抗剂AZD2098和mTORC2抑制剂JR-AB2-011进行预处理。形态学分析显示，抑制APJ或mTORC2均导致Iba-1阳性小胶质细胞分支减少、突起缩短、复杂度降低，与rApelin-13治疗组形成鲜明对比。qPCR结果显示，两种抑制剂均显著削弱了rApelin-13诱导的M2样表型标志物（CD301、MRC1、ARG1）上调。体外实验中，APJ拮抗剂ML221同样消除了rApelin-13诱导的mTORC2激活和M2标志物上调。蛋白质印迹分析证实，rApelin-13给药激活了mTORC2通路，而AZD2098或JR-AB2-011预处理均可消除这一激活效应。功能层面，阻断APJ/mTORC2轴逆转了rApelin-13的治疗获益，表现为血肿清除受损和神经行为结果恶化。
3.5 小胶质细胞APJ/mTORC2信号在神经保护中的关键作用
为排除药理学抑制剂的脱靶效应并实现细胞类型特异性干预，研究人员采用脑室内注射AAV-CD68-shRictor在ICH诱导前21天实现小胶质细胞特异性Rictor敲低。结果显示，在对照病毒组中，rApelin-13显著改善血肿清除、神经行为评分并减轻脑水肿；而在小胶质细胞Rictor敲低小鼠中，所有这些治疗获益被完全消除。形态学分析显示，Rictor敲低小鼠的小胶质细胞呈现显著简化的形态——分支数、端点数和突起长度均低于对照组。此外，Rictor敲低后M2样极化标志物的mRNA表达显著降低。这些结果共同表明，Apelin-13的神经保护作用依赖于小胶质细胞内完整的mTORC2信号传导。
四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究确立了rApelin-13通过激活小胶质细胞APJ/mTORC2信号通路、促使其向M2样抗炎表型转变，从而在ICH后发挥神经保护作用。APJ/mTORC2轴的药理学或遗传学破坏均可消除rApelin-13的治疗效应，证实了这一小胶质细胞特异性机制的必要性。既往研究已表明Apelin-13在SAH和脊髓损伤模型中具有神经保护作用，本研究进一步将这一保护作用拓展至ICH模型，并揭示了其通过神经元-小胶质细胞串扰实现的新型调控机制。研究还讨论了M1/M2表型在ICH病理进程中的不同作用，以及Apelin-13诱导小胶质细胞呈现阿米巴样吞噬形态同时表达抗炎修复分子谱的特殊激活状态。在转化应用方面，经鼻给药作为非侵入性给药途径具有绕过BBB直接递送肽类至脑部的优势，Apelin/APJ系统在多种临床前疾病模型中表现出良好的耐受性和安全性，与现有ICH干预手段（如微创血肿清除术）联合可能提供协同治疗策略。
研究结论：本研究证实Apelin-13通过激活小胶质细胞APJ/mTORC2轴减轻ICH后的神经功能缺损。这些发现为APJ在M2样小胶质细胞极化中的关键作用提供了新的见解，为ICH早期管理中靶向小胶质细胞极化的临床策略提供了新思路。
